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1、基因分析仪的检测基因分析仪的检测基因分析仪的检测基因分析仪的检测 原理及其应用原理及其应用 1 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 LIFE公司基因分析仪发展历史公司基因分析仪发展历史 3730(xl) 市场占有率: 85%，全世 界2万多台,中国1000多台 3500(xl) 1986年 全球第一台 年 全球第一台 基因分析仪基因分析仪 370 373 3773100(A) , 3130(xl) 基因分析仪基因分析仪 1996年年 310 1996年年 全球第一台 毛细管基因分析仪 全球第一台 毛细管基因分析仪
2、 平板胶电泳毛细管电泳平板胶电泳毛细管电泳 2 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 LIFE公司基因分析仪大家族公司基因分析仪大家族 310 System310 System （1道毛细管） 3500/3500(xl) System3500/3500(xl) System （8道和24道毛细管） （1道毛细管） （8道和24道毛细管） 3130/3130(xl) System3130/3130(xl) System （4道和16道毛细管） 3730/3730(xl) System3730/3730(xl) Sys
3、tem （48道和96道毛细管） 3 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 DNA分子组成分子组成DNA分子组成分子组成 G A 脱氧核糖核苷酸dNTP Adenine Guanine G A 脱氧核糖核苷酸dNTP T C CytosineThymine 4 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 测序反应的原理测序反应的原理 5 测序反应的原理测序反应的原理 O O O 无3 OH的ddNTP阻止下一个dNTP的掺入 O 3H 5 3
4、 H O 5 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/20123 OH 测序反应的原理测序反应的原理 变性变性 测序反应的原理测序反应的原理 退火退火 DNA模板模板 退火退火 引物引物 AG A C T 测序酶测序酶 荧光标记的荧光标记的ddNTP 延伸/终止延伸/终止 测序酶测序酶 荧光标记的荧光标记的ddNTP （ （BigDyeTerminator） ） dNTPs 6 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 dNTPs 荧光标记的测序反应产
5、物荧光标记的测序反应产物荧光标记的测序反应产物荧光标记的测序反应产物 ? ddNTP 被加到正在合成的链上，由于它的3-OH已被氧化，下一个dNTP 的磷酸基团能与之成磷酸酯键使合成终的5-磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键，使合成终止。 ? 测序反应的延伸阶段，ddNTP在不同位置掺入产生一系列不同长度的新的 DNA片段。DNA片段。 7 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 基因分析仪的基本构造基因分析仪的基本构造基因分析仪的基本构造基因分析仪的基本构造 CCD 相机记录所有通道信号相机记录所有通道信号 计算机分析
6、测序数据计算机分析测序数据 激光激发所有通道激光激发所有通道 毛细管毛细管 电泳方向电泳方向 高高压电压电源源 8 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 高高压电压电源源 DNA测序示意图DNA测序示意图 DNA测序示意图测序示意图 C T T G C A T G A C 序列 用点的大小代表用点的大小代表DNA分子的大小，分子的大小， 颜色代表颜色代表DNA所标记的颜色所标记的颜色 信号 颜色代表颜色代表DNA所标记的颜色所标记的颜色 检测窗口 毛细管毛细管 9 | Life Technologies Propr
7、ietary & Confidential | 5/18/2012 进样端 杂合子检测杂合子检测发现新突变发现新突变杂合子检测杂合子检测：发现新突变发现新突变 K = (GT) M = (AC) R = (AG) S = (GC) W(AT)W = (AT) Y = (CT) 10 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 基于基于HLA序列的分型序列的分型基于基于HLA序列的分型序列的分型 From 器官移植和骨髓配型前要进行供体/ 受体兼容性检测 比血清学或PCR方法更精确更可信比血清学或PCR方法更精确更可信 1
8、1 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 测序测序vs. 片段分析片段分析 测序 = 检测DNA片段中的碱基序列 测序测序片段分析片段分析 片段分析 = 分离荧光标记的片段并检测其相对大小 12 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 片段分析的原理和流程片段分析的原理和流程片段分析的原理和流程片段分析的原理和流程 标记引物标记引物5端端 生成荧光标记的生成荧光标记的 DNA片段片段 电泳电泳 数据分析数据分析 标记标记ddNTP 数据分
9、析数据分析 (大小)(大小) T G 数据分析 (基因型) 数据分析 (基因型) A T 13 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 A 片段分析的原理和流程片段分析的原理和流程片段分析的原理和流程片段分析的原理和流程 生成荧光标记的生成荧光标记的 DNA片段片段 电泳电泳 数据分析数据分析数据分析数据分析 (大小)(大小) 数据分析 (基因型) 数据分析 (基因型) 14 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 片段分析的原理和流程片段
10、分析的原理和流程 分子量标准 片段分析的原理和流程片段分析的原理和流程 分子量标准 生成荧光标记的生成荧光标记的 DNA片段片段 电泳电泳 数据分析数据分析 标准曲线 数据分析数据分析 (大小)(大小) 标准曲线 数据分析 (基因型) 数据分析 (基因型) 15 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 片段分析的原理和流程片段分析的原理和流程片段分析的原理和流程片段分析的原理和流程 生成荧光标记的生成荧光标记的 DNA片段片段 电泳电泳 数据分析数据分析数据分析数据分析 (大小)(大小) 数据分析 (基因型) 数据分
11、析 (基因型) 16 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 片段分析片段分析的的应用应用：微微卫星卫星/STR片段分析应用片段分析应用微微 Locus X (CA)n 等位基因等位基因 1 CACACA 等位基因等位基因 2 CA CA CA CA CA STR = Short Tandem Repeat 短串联重复 每个重复单位长27 nt 等位基因根据重复数不同加以区别 17 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 HID (Huma
12、n Identification，人，人类类鉴鉴定定)(类定类定) 法医鉴定- 嫌疑犯证据配型 Identifiler 定嫌疑犯据 亲子鉴定 失踪人口调查 D18S51 TPOX vWA D19S433 失踪人口调查 遇难者辨识- 残骸鉴定 重罪犯 DNA 数据库 D19S433 D2S1338 D16S539 D13S317 TH01 重罪犯 DNA 数据库 历史调查 TH01 D3S1358 CSF1PO D7S820 骨髓移植监测 (嵌合体研究) D7S820 D21S11 D8S1179 AmpFlSTRIdentifiler试剂盒 FGA D5S818 18 | Life Techn
13、ologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 Allelic Ladder的结果的结果的结果的结果 19 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 检测样品的结果检测样品的结果检测样品的结果检测样品的结果 20 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 片段分析的应用：片段分析的应用：SNP检测检测 (Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性，单核苷酸多态性)
14、SNP在人基因组中的发生频率比较高， 大约平均每300个碱基中就有1个多态 位点位点 与遗传特性，疾病易感性和药物治疗效 果有关 构建高分辨遗传图谱很好的遗传标记构建高分辨遗传图谱很好的遗传标记 21 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 单个单个SNP位点检测位点检测单个单个SNP位点检测位点检测 Enzyme P i ddAddA ddCddC ddGddG ddTddT P iPrimerPrimer AG Template Allele 1Template Allele 2 AG TC SilBE tiRt
15、i( (单碱基延伸反应单碱基延伸反应) 22 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 Single Base Extension Reaction( (单碱基延伸反应单碱基延伸反应) 单个单个SNP位点检测位点检测单个单个SNP位点检测位点检测 wt T mut C wt rfu wt/mut rfu mut rfu Homozygote = wtHeterozygoteHomozygote = mut 23 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/
16、2012 多个多个SNP位点同时检测位点同时检测 P i 不同位点的引物带不同长度的尾巴不同位点的引物带不同长度的尾巴 多个多个位点同时检测位点同时检测 TT C CAA G GTemplate Primer ddGTP ddCTPExtend and AA ddCTP ddUTP ddATP Extend and Terminate Primer TT C CAA G G AA G GTT C C 123456 24 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 5/18/2012 颜色 = 基因型颜色 = 基因型大小 = 位点大小 = 位点 片段分析的应用片段分析的应用：呼吸道病原体检测呼吸道病原体检测片段分析的应用片段分析的应用：呼吸道病原体检测呼吸道病原体检测 鼻病毒（Rhinovirus） 普通感冒 呼吸道感染（Respiratory tract infections ，
