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1、胞内S-腺苷同型半胱氨酸升高抑制HUVEC增殖和 ER-表达的关系(一)【摘要】目的探讨S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH）升高抑制血管内皮细胞增殖和雌激素受体-（estrogenreceptor-，ER-）基因表达变化的关系。方法以分离的原代人脐静脉内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC）为研究对象，经不同浓度的SAH水解酶强效抑制剂3-deazaadenosine（DZA）处理2472h后，反相高效液相色谱法测定胞内SAH浓度，利用细胞计数法、流式细胞仪和TUNEL技术检测细胞的增殖凋亡能力，West
2、ernblot法检测ER-蛋白的表达，荧光定量-PCR检测其mRNA表达，甲基化特异PCR法检测ER-基因启动子甲基化状态。结果经DZA处理后，HUVEC胞内SAH浓度升高（P0.05），生长增殖能力降低（主要受阻于G1/G0期），凋亡率增加（P0.05），ER-mRNA和蛋白的相对表达量降低（P0.05），但DZA处理前后ER-基因启动子甲基化状态不发生明显改变。结论SAH升高抑制HUVEC的增殖能力与ER-的表达变化有关，但这种作用不是通过改变ER-基因启动子的甲基化而实现的。【关键词】S-腺苷同型半胱氨酸人脐静脉内皮细胞雌激素受体-甲基化Abstract：ObjectiveToexplo
3、retherelationshipofinhibitedproliferativeabilityinducedbyintracellularS-adenosylhomocysteine(SAH)accumulationandexpressionofestrogenreceptor-(ER-)inHUVEC.MethodsAfterisolatedprimaryHUVECtreatedwithout(normal)orwith3-deazaadenosine(DZA),apotentS-adenosylhomocysteinehydrolaseinhibitor,for24-72h,intrac
4、ellularSAHlevelwasmeasuredwithreversedphasehigh-performanceliquidchromatography(RP-HPLC).TheproliferativeabilityofHUVECwasdetectedwithcytometry,flowcytometryandTUNELmethods.TheexpressionofER-proteinandmRNAwasdeterminedwithWesternblotandquantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction(qRT-PCR)
5、techniques,respectively.ThepromotermethylationofER-genewasanalyzedwithmethylationspecificPCR(MSP).ResultsTheresultsshowedthatthelevelofintracellularSAHwasincreasedinHUVECincubatedwithDZAcomparedtonormal.TheproliferativeabilityofHUVECweredecreasedandtheapoptoticratewasincreasedaftertreatmentwithDZA(P
6、0.05).TherelativeexpressionofER-mRNAandproteininHUVECtreatedwithDZAwaslowerthanthatofnormal(P0.05).ButtherewerenoobviouschangesofER-genepromotermethylationinHUVECbeforeandaftertreatmentwithDZA.ConclusionsThesefindingssuggestedthattheinhibitedproliferativeabilityinducedbyintracellularincreasedSAHwasc
7、orrelativewithER-expressioninHUVEC.Thisactionwasnotrelatedwithitspromotermethylatedpatterns.Keywords:S-adenosylhomocysteine;humanumbilicalveinendothelialcells;estrogenreceptor-;methylation随着研究的深入，人们逐渐发现血浆同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）与血管疾病间并不一定存在着必然的因果关系，蛋氨酸的另一中间代谢产物S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH）可
8、能是血管疾病的真正致病因素，而Hcy可能只是其中的一个伴随现象1。近年来人们研究证实，动脉粥样硬化（artherosclerosis，As）相关基因启动子甲基化的改变，导致其转录失调在As形成过程中拌演着重要的角色2。我们先前研究发现3-deazaadenosine（DZA）作为S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的强效抑制剂，其应用在降低Hcy的同时，可以升高胞内SAH含量，降低DNA甲基转移酶1的表达，导致整体基因组低甲基化3。为了进一步阐明SAH升高促进As形成的机制，本研究探讨了DZA对HUVEC增殖的影响与ER-基因表达变化及其启动子甲基化的关系。1材料和方法1.1主要试剂1640培养基干粉购
9、于Hyclone公司；特级胎牛血清、DeathDetectionKit(POD原位细胞凋亡检测试剂盒)购于医学科学研究院生物工程研究所；SAH标准品和DZA购自Sigma公司；CytotoxicityDetectionKit购自(RocheMolecularBiochemicals公司；CycleTESTTMPLUSDNA试剂盒购自BDBiosciencesPharmingen公司；UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0（CatDV811A）购自宝生物工程（大连）有限公司；GENMED蛋白质西方杂交印迹试剂盒（Cat.GMS30005.2）购自上海杰美基
10、因医药科技有限公司；EZDNAMethylation-GoldKit(tm)试剂盒（Cat.D5005）购自ZYMORESEARCHCORP公司。1.2细胞来源及分组取足月妊娠分娩后的新生儿脐带20cm，1.25g/L胰蛋白酶消化分离内皮细胞，1640培养基，10%胎牛血清，5CO2，37常规培养传代4。考虑SAH不能直接通过哺乳动物的细胞膜，应用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂DZA阻断SAH向Hcy的转化，从而升高胞内SAH的浓度。实验分为以下4组：对照组；5mol/LDZA处理组；10mol/LDZA处理组；20mol/LDZA处理组。处理时间分别为24、48、72h，对照组用等体积的灭
11、菌双蒸水代替DZA。经CytotoxicityDetectionKit检测乳酸脱氢酶（LDH）释放量完全排除了DZA的细胞毒性作用。1.3反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定SAH浓度提取胞浆蛋白，Bradford法测蛋白含量后，按11体积比加入等量三氯乙酸（100g/L，含4mmol/LEDTA2K)，漩涡振荡混匀，413000r/min离心10min。取20l上清液上机分析胞浆SAH的浓度（nmol/mgprotein）。检测条件：美国Waters公司高效液相色谱仪，Empower色谱工作站，Waters1525BinaryHPLCpump高压泵，7125i进样器，Waters2966
12、photodiodearraydetector紫外检测器；大连依利特HypersilBDSC18(4.6mm250mm，5m)色谱柱；柱温40；检测波长260nm；流动相50mmol/LNaH2PO4(pH=5.5)甲醇=9.50.5,流速0.8ml/min；进样量20l。1.4细胞生长曲线绘制以5104个/ml密度接种HUVEC细胞于24孔培养板中，每孔2ml，分别加不同浓度的DZA干预培养14d，每天各取3孔，台盼蓝染色，显微镜下计数非染色的活细胞数，绘制生长曲线，并按如下公式计算细胞生长抑制率（GI）=（Nc-Nt）/Nc100%，其中Nc和Nt分别为某一时相点对照组和处理组细胞数。1.
13、5流式细胞仪检测细胞周期相分布按照BDBiosciencesPharmingen公司提供的CycleTESTTMPLUSDNA试剂盒说明书进行。细胞经处理后送至中山大学免疫教研室用BDFACScan流式仪（Macintosh操作平台，BDCellQuest1.0分析软件）分析细胞周期相分布。1.6TUNEL检测细胞凋亡按照DeathDetectionKit,POD原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。主要步骤：4%多聚甲醛溶液室温固定HUVEC30min，PBS洗片，与阻断剂（0.3%H2O2甲醇溶液）室温孵育30min，PBS洗片，加通透液（0.1%TritonTMX-100溶于0.1%枸鞣酸钠
14、溶液）在冰浴中孵育2min，PBS冲洗2次，滴加50l的TUNEL反应混合液，在湿盒中37孵育60min，PBS冲洗3次，在荧光镜下分析结果并照相。1.7Westernblot法检测ER-蛋白的表达按照GENMED蛋白质西方杂交印迹试剂盒说明书进行。提取胞浆蛋白，Bradford法测蛋白含量后，取40g总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳并转移至聚偏(二)氟乙烯膜（PVDF），1%BSA的PBST（含5%tween-20的PBS缓冲液）封闭1h，1400稀释ER-单抗4过夜，PBST漂洗10min3，140稀释生物素化二抗工作液，室温振摇1h，PBST漂洗10min3，140稀释HRP标记的链酶
15、卵白素三抗工作液，室温振摇1h，PBST漂洗10min3，DAB显色，照相并进行图象分析计算ER-蛋白的相对表达量（正常组设为100）。1.8qRT-PCR法检测ER-mRNA的表达HUVEC细胞经处理后送至中山大学达安基因有限公司检测ER-mRNA的表达量。用TRIZol提取总RNA，取4lRNA模板做逆转录成cDNA。内参-actin采用RT-PCR荧光定量，ER-采用巢式RT-PCR荧光定量。-actin引物：Forward5-GCGCGGCTACAGCTTCA-3，Reverse5-TCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3，探针序列5-FAM-CACCACGGCCGAGCGGG
16、A-TAMRA-3；ER-外引物：Forward5-TGCCAGGCTTTGTGGATTTG-3，Reverse5-GCCGCTGCATGACCTCCT-3，内引物：Forward5-TCTCGTCTGGCGCTCCAT-3，Reverse5-CTGGTTCCTGTCCAAGAGCAA-3，探针序列5-FAM-CACCCAGGGAAGCTACTGTTTGCTCCTAA-TAMRA-3。所有引物由上海生工合成。ER-mRNA的相对表达量为ER-拷贝数与-actin的拷贝数之比。1.9MSP法检测ER-基因启动子甲基化按照UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0（Cat.DV811A）说明书提取DNA，按照EZDNAMethylation-GoldKit(tm)试剂盒（Cat
