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1、高中组 11年级生物化学3人项目重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化摘要： 干扰素（Interferon gamma，IFN-）是体内重要的细胞因子，能够通过调控免疫相关基因的转录协调机体的免疫反应，具有抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力能功能。目前对于IFN-、IFN-重组表达的较多，而关于IFN- 蛋白的纯化表达较少.因此,本研究使用PCR方法扩增IFN-基因，将IFN-基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30-IFN-，转化大肠杆菌BL21和Rosetta菌株，在IPTG诱导下表达IFN-，SDS-PAGE分析重组表达蛋白。
2、结果表明：成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-；表达产物主要以包涵体形式存在；经Ni2+-NTA亲和层析纯化，获得高纯度重组蛋白。本实验纯化的蛋白有望在今后用于医学和生物学研究中。关键词：干扰素；IFN- 蛋白；大肠杆菌表达系统；重组表达；蛋白纯化；1、 研究背景干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒（比如：乙肝病毒）的复制。其类型分为三类，-（白细胞）型、 -（成纤维细胞）型，-（淋巴细胞）型；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰
3、素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。其中，IFN-是体内重要的免疫调节因子，能通过与细胞表面受体结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作用。 在诱导效应因子表达的同时，由于IFN-能够提高细胞表面MHC分子的表达，增强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，从而协同促进了机体对病毒感染细胞的杀灭，而使机体处于抗病毒状态。虽然各种类型的干扰素均能介导细胞对病毒感染的反应，但 IFN- 的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期
4、的抗病毒状态中发挥更为重要的作用。其作用可大致总结为以下几点： 抗增生作用。这是干扰素能用于治疗多种肿瘤的原因。 抗病毒作用。当我们的机体感染病毒时，体内会产生大量的干扰素。 免疫调节作用。干扰素是天然免疫的一部分，但干扰素也参与多种特异性的细胞免疫，如增强感染的肝细胞表达被T淋巴细胞识别的蛋白质，帮助T细胞识别病毒感染的细胞等。 抗纤维化作用。这是为什么干扰素治疗的病人肝纤维化会明显好转。 干扰素还有抗新血管增生、促进细胞凋亡等多种功能。但在治疗慢性乙肝方面，抗病毒作用和免疫调节作用，以及抗纤维化作用可能是主要的。由于IFN- 能够抑制细胞增生，促进细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成，具有抗病毒及免
5、疫调节活性，还可抑制癌基因的表达，因此引起了人们对其在治疗恶性肿瘤方面的关注。目前，已有文献报道将IFN-用于肝细胞癌（Hepatic cellular carcinoma，HCC）切除术后和消融术后，以预防复发，如Nishisuchi等对 30 例行 HCC 根治性术后患者进行长达 88 周的IFN-治疗，结果显示，IFN- 治疗可提高术后患者的累积生存率。Lin 等也对行消融术后的 HCC 患者进行 IFN- 治疗，结果发现 IFN- 能够降低肿瘤复发率，提高患者生存率。IFN-局部用药，还可治疗暴露性肿瘤，如恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、宫颈癌等。所以我们对其进行了分析与纯化，进一步了解其成
6、分和结构，并纯化出有用蛋白进行加以利用。2、 研究目的目前对于IFN-、IFN-重组表达的较多，而关于IFN- 蛋白的纯化表达较少；因此本研究希望通过实验研究，在大肠杆菌表达系统中成功表达IFN- 蛋白，并利用蛋白纯化技术获得较纯的IFN- 蛋白。3、 材料与方法1. 大肠杆菌表达载体构建1.1 材料DH5a感受态细胞(TAKARA)；Antibotics(Sigma)；Restriction enzyme(TAKARA)；DNA Ladder(Novoprotein)； pCold II；载体(TAKARA)； 1.2 仪器及品牌PCR仪(ThermoFisher)； 水平电泳仪(大连竞脉)
7、； 凝胶成像仪(上海天能)；台式离心机(湖南赛特)1.3 方法1.3.1 PCR扩增目的基因 设计引物，以含目的基因质粒为模板，PCR扩增IFN-gamma目的基因。1.3.2 重组表达载体构建 经PCR扩增胶纯化获得目的基因，用Nde I 和Hind III酶切并胶纯化获得载体pCold II。目的基因片段与pCold II以Sea mLess cloning方法重组克隆，转化DH5a感受态细胞，PCR鉴定阳性克隆，并测序。2. 大肠杆菌表达筛选2.1 材料 XY1培养基(Novoprotein)； IPTG(Sigma)； Protein Molecular Marker(Novoprot
8、ein)；Antibotics(Sigma)； Rosetta pLysS表达菌株(TAKARA)； Antibodies(Sigma)；2.2 仪器及品牌高速冷冻离心机(Beckman)； 摇床(上海博彩)； 超声破碎仪(宁波新芝)； 垂直电泳仪(上海天能)2.3 方法 重组质粒转化BL21(DE3)表达菌株，37培养至OD600=0.8后，加 IPTG(1mM) ，37诱导3 h，收菌。SDS-PAGE检测表达。 重组质粒转化BL21(DE3)表达菌株，37培养至OD600=0.8后，冷却后加 IPTG(0.1mM) ，16诱导过夜，收菌。SDS-PAGE检测表达。 重组质粒转化Roset
9、ta pLysS表达菌株，37培养至OD600=0.9后，加 IPTG(1mM) ，37诱导3 h，收菌。SDS-PAGE检测表达。 重组质粒转化Rosetta pLysS表达菌株，37培养至OD600=0.9后，冷却后加 IPTG(0.1mM) ，16诱导过夜，收菌。SDS-PAGE检测表达。Antibotics(Sigma)； Rosetta pLysS表达菌株(TAKARA)； Antibodies(Sigma)；3. 蛋白纯化3.1 材料 基本无机试剂(Na2HPO4，KCl，NaCl等)(国药化学集团)；透析袋(上海绿叶)超声破碎仪(宁波新芝)；AKTA purifier(GE)；高
10、速冷冻离心机(Beckman)；垂直电泳仪(上海天能)Chelating HP(Ni)亲和纯化色谱柱(柱体积1 mL)3.2方法 Chelating HP(Ni)柱以20mM PB，500mM NaCl， pH 7.4平衡液平衡，平衡后上样90 mL，然后分别用含20，50，100， 200， 500mM 咪唑的20mM PB，500mM NaCl，pH7.4的洗脱液洗脱。其中500mM咪唑洗脱流份透析到最终缓冲液中作为蛋白产品保存。4. 成品检测4.1仪器及品牌 垂直电泳仪(上海天能)；核酸蛋白检测仪(Eppendorf)；4.2 方法 终产品进行浓度，纯度检测合格后按要求分装保存。四、实验
11、结果与讨论4.1 表达载体的构建（包括目的基因的扩增，酶切、连接和转化，阳性克隆鉴定）4.1.1目的基因扩增n 用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因（506 bp） M 1 Lane1： IFN-gamma (506bp) M：Dl2000 DNA Marker图1. 目的基因扩增4.12酶切、连接和转化n 将扩增的目的基因用限制性内切酶消化；n 连接到相应的空载体；n 将构建好的载体转入大肠杆菌4.13阳性克隆的鉴定n 用聚合酶链式反应（PCR）确认正确的构建载体 1 2 3 4 5 6 M Lane1-6: Clone 1-6 (expected product length 600bp
12、)Mk: DL 2000 DNA MarkerPositive clone:1-6Positive clone for sequencing: 1，6Sequencing correct clone :1，6图2. PCR鉴定阳性克隆4.2表达筛选（包括表达小试确定最佳的表达条件，放大培养）4.2.1表达小试1n 菌株：BL21(DE3)n 培养基： LBn 在600 nm波长光吸收值达到1.0时加入1 mmolIPTG在37培养3 h B1 B2 B3 B4 MK A B C D Lane A: 诱导前全菌Lane B: 诱导后全菌Lane C: 破菌上清 Lane D: 破菌沉淀MK: 分
13、子量标记图3. SDS-PAGE检测表达条带从SDS-PAGE电泳上可以看出目的蛋白有明显的可溶表达。4.2.2表达小试2n 菌株：BL21(DE3)n 培养基：LBn 600 nm波长光吸收值达到1.0时加入0.1 mmolIPTG在16培养16 h B1 B2 B3 B4 MK A B C D Lane A: 诱导前全菌Lane B: 诱导后全菌Lane C: 破菌上清 Lane D: 破菌沉淀MK: 分子量标记图4. SDS-PAGE检测表达条带从SDS-PAGE电泳上可以看出目的蛋白有明显的可溶表达4.2.3表达小试3n 菌株：Rosetta pLysSn 培养基： LBn 在600
14、nm波长光吸收值达到1.0时加入1 mmolIPTG在37培养3 h B1 B2 B3 B4 A MK B C D Lane A: 诱导前全菌Lane B: 诱导后全菌Lane C: 破菌上清 Lane D: 破菌沉淀MK: 分子量标记图5. SDS-PAGE检测表达条带从SDS-PAGE电泳上可以看出目的蛋白有明显的可溶表达。4.2.4 表达小试4n 菌株：Rosetta pLysSn 培养基：LBn 在600 nm波长光吸收值达到1.0时加入0.1 mmolIPTG在16培养16 h B1 B2 B3 B4 A MK B C D Lane A: 诱导前全菌Lane B: 诱导后全菌Lane C: 破菌上清 Lane D: 破菌沉淀MK: 分子量标记图6. SDS-PAGE检测表达条带从SDS-PAGE电泳上可以看出目的蛋白有明显的可溶表达。4.2.5 放大培养n 菌株: BL21(DE3)n 培养基: XY1 2升n 在600 nm波长光吸收值达到1.0时加入0.5 mmolIPTG在37培养3 hLane A: 诱导前全菌Lane B: 诱导后全菌Lane C: 破菌上清 Lane D: 破菌沉淀MK: 分子量标记 MK A B
