elisa讲义

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1、ELISA、酶标仪、洗板机,免疫测定依靠的是抗原抗体反应 抗原抗体反应的四个特性,1 抗原抗体反应首先是可逆性,抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为： Ag+AbAgAb,抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=AgAbAgAb ,AgAb的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固。结合后可解离，解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。,2 抗原抗体反应其次是特异性,抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。 测定某一特定的物质，而不

2、需先分离待检物。,3 抗原抗体反应显现需合适比例,4 抗原抗体反应的敏感性,化学比色法的敏感度为mg/ml水平 酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml 免疫测定中酶标记的免疫测定，由于酶的催化效率很高，间接放大了免疫反应的结果，因此酶联免疫测定的敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平 例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。,免疫测定在临床检验中的应用 由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。 如性激素的残留测定,酶免疫测定类型,酶免疫技术,酶免疫组化,酶免疫测定,均相酶免疫测

3、定,非均相酶免疫测定,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immuno- sorbent assay , ELISA) 。 1971年瑞典、荷兰学者报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术（immunoassay，IA） 。,ELISA检测方法的关键,基础: 1. 抗原或抗体的固相化。 2. 抗原或抗体的酶标记。,基 本 原 理,它采用抗原与抗体特异的免疫反应

4、将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，显色产物的量与标本中受检物质的量直接相关，因此用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。 在这种测定方法中有3种必要试剂： 固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） 酶标记的抗原或抗体（标记物） 酶作用的底物（显色剂）,测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）发生免疫反应结合后，,再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。,其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。 这种有色产物可用肉眼、

5、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。 其方法简单，方便讯速，特异性强。,酶标（ELISA）,ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。 以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术 自上世纪70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。,1. ELISA的原理 2. ELISA的类型 3. 试剂准备：免疫吸附剂 结合物 酶底物的准备 4. 对照设定 5. 标本的采取和保存 6. 结果判断,ELISA是

6、一种免疫测定（immunoassay，IA） 。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。,1. ELISA的原理,ELISA技术原理,1. 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 2. 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性。 3. 酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。 4. 受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。 5. 此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。 6. 加入酶反应的底

7、物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重复性好。,1.1 抗原抗体反应,1.1.1 可逆性,抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为： Ag+AbAgAb,抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=AgAbAgAb ,AgAb的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。,1.1.2 特异性,抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗

8、体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。 测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。,1.1.3 最适比例,1.1.4 敏感性,化学比色法的敏感度为mg/ml水平 酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml 免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿 标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平 例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。,2 ELISA的类型,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂“（immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物“（co

9、njugate）； （3）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法。,双抗体夹心法测抗原,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。,样品（抗原）,酶标抗体,底物,酶标仪测定OD值,终止液,双抗原夹心法测抗体,用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。,3. ELISA的试剂(A、B、C三部分),ELISA

10、中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。 （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；A （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； B （3）酶的底物； C （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品； （5）结合物及标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液,3.1 ELISA的试剂准备 A,固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。 良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。 将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。 封闭(blocking)是

11、继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。 常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。 洗涤液：在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。,3.2 ELISA的试剂准备 B,结合物 即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂 1. 酶的催化活性 2. 抗体（或抗原）的免疫活性 3. 含有或少含有游离的抗体（或抗原） 4. 结合物尚要有良好的稳定性。,酶 纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳

12、定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。 酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。 在ELISA中，HRP（辣根过氧化物酶），AP（碱性磷酸酶），葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。,结合物用的抗原和抗体 制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在ELISA中用酶标抗原的模式

13、不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。,3.3 试剂准备 C 酶的底物,E,3.3.1 HRP的底物,HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。,AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。,3.3.2 AP的底物,3.3.3 酶反应终止液 常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用

14、2mol/L。,3.4 对照设定,阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。 阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。 加入的量应与试剂的敏感度相称； 在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。,参考标准品,定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中.,阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中

15、不可含HBsAg，最好抗HBs也是阴性。,酶标基本步骤,用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为110gml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。 2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。 3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37孵育0.51小时，洗涤。 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制

16、的TMB底物溶液0.1ml 371030分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELX808酶标仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。,加样,在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。,基本操作注意事项：,基本操作： 加样； 温育； 洗涤； 读板；,温育,抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)。 温育常采用的温度有43、37、室温和4（冰箱温度）等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。,洗