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1、电镜在细胞凋亡研究中的应用 Application of Electron Microscopy for Appotosis study,重庆医科大学电镜室 罗子国,一、细胞凋亡概论,1、细胞凋亡的概念 细胞凋亡（Apoptosis)或称程序性坏死（Programmed cell death, PCD)。它是不同于细胞坏死（necrosis)的另外一种死亡方式，它贯穿于生命始终。如：树木的落叶，蝴蝶的变态,细胞凋亡不仅参与正常成年组织细胞更新（如血细胞发生、衰老细胞清除）、成年生理器官内分泌的调控（如子宫产后复旧）等重要的生,理过程，而且是胚胎发育、神经及免疫系统发育成熟的重要调控机制。同时细
2、胞凋亡与增殖的失衡是肿瘤发生的重要机制。 细胞坏死是细胞突发性病理性的死亡或生理环境急聚变化（如高热缺氧等）所致。由于细胞膜的直接破坏而引起大量胞外水、电解质进入细胞内，只是细胞稳态失衡，造成细胞器特别是线粒体肿胀进而细胞破裂。如能及时去除引起细胞损伤的因素，上述早期反应尚可逆转。早期反应包括细胞凋亡对机体的许多正常生理功能具有重要意义。,2、细胞凋亡与程序性坏死 程序性坏死（Programmed cell death, PCD)最早是是由发育生物学家研究动物发育过程发现的，细胞凋亡是形态学概念而程序性坏死是功能性概念，程序性坏死主要由细胞凋亡所引起，程序性坏死仅存在于发育细胞中。与细胞凋亡的
3、比较如下：,3、细胞凋亡的形态学特征 最早发生的改变是核异染色质边集 ，分布于核膜下。而后，核染色质进一步浓集，核固缩，逐步分裂为碎片。与此同时，细胞之中的细胞器及基质也发生浓缩,失去水分。凋亡细胞皱缩,但胞膜完整。最后，质膜下陷，包裹核碎片及细胞质形成多个 凋亡下体（Apopotic bodies),凋亡小体外被质膜，可含核碎片也可仅含胞质成分。凋亡小体一般被巨噬细胞吞噬。 凋亡的发生和发展可分为：信号传递、中央调控结构改变三个阶段：,（1）、信号传递阶段：诱导凋亡的细胞外因素与细胞表面的死亡受体结合，将信号传入细胞内。 （2）、中央调控阶段：传入细胞的信号分子，激活半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶
4、家族，引起一系列酶族级联反应。 （3）、结构改变阶段：凋亡细胞出现前述超微结构改变。,4、细胞凋亡的应用前景 细胞凋亡是多细胞生物体重要的生理机制，对维持机体内环境稳定起重要作用，但该机制一旦失活可导致各种疾病。应该利用现代技术进一步深入探讨细胞凋亡的机制及细胞凋亡疗法。从目前国内外研究现状和前景来看，细胞凋亡研究有着广阔的应用前景。 （1）探讨疾病的发生机理 现已发现正常和肿瘤组织内部均发生自发性细胞凋亡，而一旦凋亡受到抑制就会导致肿瘤，另一方面许多疾病的发生与细胞生理性死亡的速度加快有关，如再障等,（2）探讨药物及其他治疗手段的机制 以细胞凋亡为研究手段，探讨药物及其他治疗手段的作用机制和
5、耐药性，寻找新的治疗药物和方法。 （3）在分子水平实现人为调控细胞凋亡，达到治疗疾病的目的 通过深入研究细胞凋亡的发生机制及其基因调控，并进行相关基因的分离和克隆，有望人为地调控细胞凋亡，提高治疗效果，预防疾病的发生。 应用现代分子生物学技术（反义技术、基因导入技术）从调控细胞凋亡角度探索防止神经退化性疾病、艾滋病和肿瘤的有效措施，目前已有人在进行多方面尝试。,二、细胞凋亡的研究方法,随着细胞凋亡研究的日益发展，如何在体外对细胞凋亡进行检测，以便于在科研和临床医疗实践中更好地利用细胞凋亡机制并建立有效的细胞凋亡检测手段已成为当务之急。目前，有关细胞凋亡的实验室检测手段主要是从细胞凋亡的形态学和
6、生物化学特征对其进行体外的定性和定量研究。细胞凋亡的研究方法很多。但在具体的凋亡研究中，不可能也不需要对每种方法进行尝试，怎样才能做到既能达到研究目的，又能减少不必要浪费和工作量，是每个研究者所要考虑的问题。,研究凋亡的方法大致可分为以下三类： 、根据方法的定量定性特性分为： （）只能定性的方法：琼脂糖凝胶电泳、形态学 （包括光镜、电镜）观察等；（）能进行定量或 半定量的方法：流式（）、原为末端标记法、定量琼脂糖凝胶电泳。 2、根据是否能将凋亡和坏死区分：能区分包括琼脂糖凝胶电泳、形态学（包括光镜、电镜）及双染色流式细胞仪。不能区分的包括原为末端标记法和单染色流式细胞仪。 3、根据样本来源选择
7、不同的方法：,细胞凋亡的形态学检测 细胞凋亡本身是一个形态学概念，形态特别是细胞核的形态学变化是凋亡细胞最典型的特征，因此形态学不仅是判断凋亡细胞的基本参数，而且也是鉴定凋亡细胞最可靠的方法。在凋亡形态鉴定的各种方法中，除流式细胞仪外，其他检测手段均不能很好地对凋亡细胞做定量分析，而且费时、费力、重复性欠佳。但形态学观察简便、直观，并可保存标本。其中电子显微镜以其高放大、高分辩为首选。,三、电镜在细胞凋亡研究中的应用,在细胞凋亡发展过程中电子显微镜科观察到一系列不同于细胞坏死的形态学变化。凋亡的共同特征时细胞体积的收缩，以细胞核的形态变化尤为突出，但并不引起炎症反应。电镜下早期凋亡细胞体积缩小
8、，失去细胞连接和一些特殊膜表面结构,如微绒毛的消失，异染色质边集，但质膜及细胞内膜依然完整。然后核体积进一步缩小，并可裂解唯一或数个致密体，与其相联的细胞质形成具有完整模型结构的凋亡小体，随之凋亡小体,要获得好的电镜观察结果和图片除了实验本身成功意外，电镜样品的处理、标本的制备及必需的超微结构水平十分关键。因此，我要给大家介绍电镜样品处理和制备的相关内容.,第一部分 常规透射电镜样品制备技术,超薄切片（ultrathin-section）制备过程示意图：,二、常规游离细胞样品处理方法： 1、琼脂离心管的制备：选优质琼脂，用双蒸水配成2%的浓度，加热溶解。在一个10ml的锥形离心管放一个尖端细的
9、棒芯（可用有机塑料杆自制），灌入溶化的琼脂，凝固后抽出棒芯备用。 2、取材固定方法 （1）细胞收集:1x106，PBS洗一次，置离心管中离心10分钟，8001000转/分。 （2）用1.0M PBS5ml重悬5分钟。 （3）将细胞悬液吸入有琼脂空槽的离心管中。 （4）离心，8001000转/分10分钟。 （5）取出离心管内的琼脂，仔细切下尖草内含细胞团的琼脂块。,（6）将含细胞团琼脂块投入2.5%戊二醛固定， 4保存。 （7）用0.1M PBS清洗一次。 （8）1%四氧化锇后固定3060分钟。 （9）进入常规程序。,SEM生物样品制备的基本要求 （一）每一处理步骤及操作过程中，都应注意防止对样
10、品的污染和损伤，使被观察的样品尽可能地保持原有的外貌及微细结构。 (二）去除样品内的水份，以利于维持SEM的真空度和防止对镜筒的污染。但在脱水和干燥处理时，要尽量减少和避免样品体积变小，表面收缩变形等人工损伤。 （三）降低样品表面的电阻率，增加样品的导电性能，以提高二次电子发射率，建立适当的反差和减少样品的充放电效应。 （四）无论观察组织细胞的表面或内部微细构造，都应注意确认和保护样品的观察面。,SEM生物样品的制备的基本操作程序,培养细胞： 组织培养细胞如培养在培养瓶内的盖玻片上，可倒去培养液，加入冷的戊二醛进行固定、清洗、1%锇酸后固定、脱水和浸透。浸透以后用柔软的皱纸轻轻吸干包埋液，用刀
11、片将盖玻片上的细胞刮下成团，放入胶囊的底部中心，再将胶囊注满包埋液，在烤箱内固化。有的细胞直接生长在培养瓶壁上，可先用0.1%的胰酶将细胞从瓶壁上分离下来，在离心管内离心成块（速度为15002000r/min，时间为1015min），再进行固定，按常规方法制备。 细胞样品：,白细胞制样：经1%肝素抗凝的静脉血45ml，放入塑料离心管内，以1500r/min的速度离心1520min，然后吸去表面血浆，可见淡黄色透明层，不要搅动，再沿着管壁缓缓加入戊二醛，置冰箱内固定约30min，用一段弯曲的长针，轻轻取出透明层，切成约1mm3小块，再用戊二醛进一步固定。随后可按常规样品制备方法制备。 血小板制样
12、：取抗凝血约810ml，先低速离心抗凝血（400r/min，10min），得到富含血小板的血浆，把此血浆和预温到37的0.1%戊二醛等量混合，置37孵箱内半小时作轻微的表面固定。再以15002000r/min的速度离心10min，弃去上清液，把沉淀出的血小板用37的2.5%戊二醛在孵箱内固定2小时，随后步骤和常规制片相同。,游离细胞样品制备法： 游离细胞（如血细胞、精子及其他组织培养细胞等）的SEM样品制备，具有一定的特殊性，现仅就一般常用的方法及注意事项作一简要介绍。 样品的清洗与固定：由于游离细胞易受渗透压的影响，以选用低浓度的固定液和等张的清洗液为宜。一般在小型烧瓶内加入1%戊二醛20m
13、l磷酸缓冲液配制），再滴入23滴细胞混悬液，用力摇动数分钟，即可除去血细胞和精子表面附着的血浆或精液，而达到清洗和固定双重目的。亦有人主张，可先用等张溶液对样品进行清洗，而后再作固定。,样品的脱水与干燥：把经过清洗，固定及离心（15004000转/分，35分钟）的样品，滴在滤纸或光镜盖玻片上，而后进行系列脱水和临界点干燥，若采用滴在盖玻片上的方法，在脱水和临界点干燥时，细胞有可能被冲走或吹掉。为了避免发生上述情况。可将载有样品的玻璃片放在平皿内，采用吸管滴加或吸走递增浓度的乙醇，使样品脱水和进行中间液处理。再将其包在滤纸内作临界点干燥，有条件者，最好选用干冰临界点干燥法，可使样品得到比较充分的保护。 注意滴加样品时，细胞浓度要适当，尽量使细胞呈单层排列，以利观察。所用的盖玻片，最好先在其表面喷镀金一簿层金属膜，以减少充放电现象的发生。样品表面金属镀膜和SEM观察，与一般方法相同。,谢 谢！,
