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1、核酸提取原理及常见问题,第一部分:DNA提取方法简介,第二部分:DNA提取常见问题、 原因分析及其对策,内容,第三部分:RNA提取方法简介,第四部分:RNA提取常见问题、 原因分析及其对策,基因组DNA的提取,CTAB法 SDS法 酚氯仿法 试剂盒法,DNA提取的几种方法,CTAB法原理,CTAB,是一种阳离子去污剂,可破碎细胞壁和细胞膜,并与核酸形成复合物。 在高盐溶液中 ( 1.4 mol / L NaCl ) 是可溶的 ,当降低溶液盐浓度到一定程度( 0.7 mol /L NaCl )时 ,从溶液中沉淀 。通过离心 , 可将 CT A B 核酸复合物同蛋白质 、 中性多糖类物质分开 。
2、溶解于高盐溶液中的 CTA B 核酸复合物 , 加入乙醇可使核酸沉淀 ,而 CT A B 则溶于乙醇.,注:CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15。,CTAB法(植物DNA提取经典方法),CTAB提取缓冲液的经典配方,Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏; EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性; NaCl 提供一个高盐环境,使DNP(脱氧核糖核蛋白)易于溶解。 CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离; -巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除,
3、细胞裂解后释放的植物次生代谢产物和多酚类化合物易于氧化 ,氧化的多酚结合到DNA 分子上而致 D N A 降解; 多糖的性质与核酸类似,会与核酸一同沉淀下来,影响植物核酸纯度。,CTAB提取缓冲液的改进配方,PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。 同时向抽提液中加入还原剂-巯基乙醇,后者能打断多酚氧化酶中的二硫键,使多酚不易被氧化,随后经抽提而去除。,改良方法 1,改良方法 2,加入核酸分离缓冲液,利用高温加热裂解细胞,去除部分杂质,离心得到细胞核; 针对多糖组织,得到细胞核之后可加入1XP
4、BS清洗2-3次,去除多糖; 后续使用CTAB裂解液裂解细胞核。 核酸分离缓冲液:200mM Tris-HCl 50mM EDTA 250mM NaCl 2%PVP,CTAB法流程图,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,SDS法原理,SDS法,SDS是一种阴离子去垢剂,在高温(5565)条件下能裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸; 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度(冰浴),使蛋白质及多糖杂质沉淀,离心后除去沉淀; 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,SDS法DNA提取缓冲液,SDS
5、 法操作简单 , 温和 , 也可提取到较高分子量 DNA ,但所得产物含糖类杂质较多 CTAB法的最大优点是能较好地去除糖类杂质,SDS法流程图,酚氯仿裂解法,苯酚抽提原理:,使蛋白质变性,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。 酚的优点:1. 有效变性蛋白质;2. 抑制了DNase的降解作用 酚的缺点: 能溶解10-15%的水。 最后用氯仿抽提:克服酚的缺点;加速有机相与液相分层;去除核酸溶 液中的迹量酚。(酚易溶于氯仿中) 用酚氯仿抽提细胞基因组DNA时,通常要在酚
6、-氯仿中加少许异戊醇,减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡产生。另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。,用乙醇沉淀DNA时,通常要在溶液中加入单价的阳离子,如NaCl 或 NaAc,Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,而易于聚集沉淀。,DNA提取常见问题,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反应 DNA中残留有金属离子,重新纯化DNA,去除蛋白、多糖、多酚等杂质 重新沉淀DNA,让酒精充分挥发 增加70乙醇洗涤的次数(2-3次
7、),问题一:DNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应。,原 因,对 策,材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈,DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融,尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融,问题二:DNA降解。,对 策,原 因,实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全 洗涤时DNA丢失,尽量选用新鲜(幼嫩)的材料 动植物
8、要匀浆研磨充分;G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 高温裂解时,时间适当延长(对于动物细胞、细菌可增加PK的用量) 低温沉淀,延长沉淀时间 加辅助物,促进沉淀 洗涤时,最好用枪头将洗涤液吸出,勿倾倒,问题三:DNA提取量少。,对 策,原 因,RNA的提取,异硫氰酸胍/苯酚法(如Trizol法) CTAB法 试剂盒法,RNA提取,异硫氰酸胍/苯酚法,原理: 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解,同时核蛋白体上的蛋白变性,核酸释放; 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相,从而得以分离; 有机溶剂抽提,沉淀,得到纯净RNA。,Trizol法适用
9、于普通的植物组织、动物组织以及真菌和细菌等。,酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆地结合,导致RNA活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时RNA的丢失,或形成不溶性复合物; 而多糖会形成难溶的胶状物,与RNA共沉淀下来;萜类化合物和RNase会分别造成RNA的化学降解和酶解。,针对多糖多酚植物,可以采用CTAB法和Trizol法结合的方法,针对性的去除多糖多酚。 对于富含色素、蛋白和多糖的藻类,可采取试剂盒方法。 组织量较少的样品,在沉淀时刻加入糖原,增加终浓度等。,影响RNA提取的因素,材料: 新鲜,切忌使用反复冻融的材料 如若材料来源困难,且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样
10、品贮存液中,于80保存 液氮长期保存,80短期保存,样品破碎及裂解: 根据不同材料选择不同的处理方法: 培养细胞:通常可直接加裂解液裂解 酵母和细菌:直接液氮研磨,之后用Trizol裂解 动植物组织:先液氮研磨和匀浆,后加裂解液裂解。有些样品如肌肉或者动物脏器需要加入裂解液后进行湿磨,以充分研磨。 为减少DNA污染,可适当加大裂解液的用量,纯化: 在使用氯仿抽提纯化时,一定要充分混匀,且动作快速; 经典的沉淀方法,如 LiCl 沉淀等,虽然经济,但操作时间长,易造成 RNA 降解; 异丙醇沉淀,用时短,但所获得的RNA杂质较多; 柱离心式纯化方法:抽提速度快,能有效去除影响 RNA 后续酶反应
11、的杂质,是目前较为理想的选择。,RNA提取常见问题,RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低 总量偏低,RNA降解,样品取样以及保存是否得当 裂解液的质量 外源RNase的污染 裂解液的用量不足 组织裂解不充分 另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏,胸腺等),很难避免 RNA 的降解。,OD260 /OD280 比值偏低,蛋白质污染: 不要吸入中间层及有机相,加入氯仿后首先混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。 减少起始样品量,确保裂解完全、彻底 苯酚残留: 不要吸入中间层及有机相,加入氯仿后首先混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。,抽提试剂残留: 确保洗涤时要彻底悬浮 RNA,并且彻底去掉 75% 乙醇。 设备限制: 测定OD260 及OD280 数值时,要使OD260 读数在 0.10 - 0.50 之间。此范围线性最好。 用水稀释样品: 测 OD 时,用水作为稀释液将导致比值的降低。,总量偏低,跟组织本身的RNA丰度有关,一般代谢旺盛的组织RNA得率会比较高。 解决方案:加入糖原,帮助RNA沉淀 多提几管,最后合并溶解。,正常条带,常见的几种RNA条带,植物叶片,水生生物和昆虫等 “ 隐裂”现象,真菌和细菌等,动物组织,谢谢,