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1、中药中黄曲霉毒素的测定,目录,真菌毒素简介 黄曲霉毒素概述 黄曲霉毒素现有检测方法介绍 黄曲霉毒素检测药典收载情况 药典检测方法详解 注意事项及实验室建议,真菌毒素简介,真菌毒素：由产毒真菌在适宜的环境条件下产生的有毒代谢产物，由真菌菌核产生。 Mycotoxin：源于希腊语（Mykes）和拉丁语（Toxicum）,常见真菌毒素分类,真菌毒素监控意义,真菌毒素对食品安全的危害 真菌毒素对种、养殖业的危害 真菌毒素对制药行业的危害（中药） 国际贸易中作为技术壁垒 在国际反恐和战争中，真菌毒素可作为大规模杀伤性生化武器,黄曲霉毒素概述,黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等菌种产生的次生代谢产物,黄曲霉毒
2、素的发现,1960年，在英国东南部一些农场中，有大约10万只火鸡不明原由地突然死亡。 1961年发现火鸡饲料中混有的花生粉能够使大鼠诱发肝癌。 1962年，研究发现花生粉中含有一种荧光物质是导致。火鸡死亡的病因，这种荧光物质被证实为黄曲霉的代谢产物，故命名为“黄曲霉毒素(Aflatoxins)”。,存在极其广泛,主要存在于土壤，动植物及各种坚果中。家庭自制发酵食品等也经常发现黄曲霉毒素。 一般在热带和亚热带地区，食品中黄曲霉毒素的检出率比较高。 未能及时晒干或储藏不当的粮食容易产生，在农作物正常的生长期中也可以形成。,毒性极强,1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构（IAR
3、C）划定为类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质，仅次肉毒毒素，是目前已知霉菌中毒性最强的。 急性毒性：比氰化钾大10倍，比砒霜大68倍 慢性毒性：肝脏损害，呈急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和胰脏也有轻度的病变。,中药中容易产生黄曲霉毒素的品种,种子、果实、粮谷类中药材 发酵类中药材 动物类中药材 油性成分多的中药材 含上述种类药材的中成药,黄曲霉毒素的种类及性质,根据在紫外线照射下产生荧光颜色的不同，分为B族和G族两大类及其衍生物,蓝色荧光,黄绿色荧光,化学结构,基本结构：是一组化学结构类似的二呋喃香豆素的衍生化合物 目前发现约20余种，已分离鉴定出12种：B1、B2、G1
4、、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。 B1：最常见、毒性及致癌性最强,化学结构式,理化性质,黄曲霉毒素相对分子量312346 难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚 在中性及酸性溶液中较稳定，但在pH为13的强酸性溶液中稍有分解，在pH为910的碱性溶液中分解迅速,纯品为无色结晶 耐高温，黄曲霉毒素B1的分解温度为268 紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性,黄曲霉毒素现有检测方法介绍,薄层层析法：灵敏度低，定量困难 HPLC-紫外检测法：不衍生，灵敏度低，采用UPLC可以增强灵敏度 HPLC-荧光检测法：需衍生，灵敏度高 高效液相色谱
5、-串联质谱法：不需衍生，灵敏度高，假阳性少，成本高,免疫化学分析方法 酶联免疫吸附法：快速、简便、单一毒素、假阳多 免疫亲和柱-荧光分光光度法：高效、无毒、假阳多 微柱筛选法：半定量，测总量 一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法：快速、现场大批量初筛,黄曲霉毒素检测药典收载情况,2005年增补本附录 第一次增加了黄曲霉毒素测定法 2010年版一部 正文：僵蚕、陈皮、酸枣仁、桃仁、胖大海品种项下增加了黄曲霉毒素残留量检查 附录：继续收载了黄曲霉毒素测定法,2010年版一部第二增补本修订了附录方法 删除了流速规定 增订了另一种衍生方法：即光化学衍生法 取消了免疫亲和柱的品牌规定 2015年版四部通则23
6、51黄曲霉毒素测定法 增加了第二法：高效液相色谱-串联质谱法 增加附注：“当测定结果超出限度时，采用第二法进行确认”,2015年版四部通则增加中药中真菌毒素测定指导原则 基本原则（中药中真菌毒素的分类、监控品种、测定方法、限值拟定） 基本内容（高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法）,2015年版四部通则9302 中药有害残留物限量制定指导原则中关于黄曲霉毒素的规定 “由于黄曲霉毒素毒性强，目前国际上不建议设定黄曲霉毒素的安全耐受量和无毒作用剂量，也无最大限量理论值计算公式，限量越低越好”。,中国药典2015年版正文收载品种,根及根茎类：远志 果实种子类：大枣、肉豆蔻、决明子、麦芽、陈皮、使
7、君子、柏子仁、胖大海、莲子、桃仁、槟郎、酸枣仁、薏苡仁 动物类：僵蚕、水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣,共19种，较2010年版药典增加14种,黄曲霉毒素药典检测方法详解,液相条件：C18，甲醇-乙腈-水（40:18:42） 衍生方式：柱后碘衍生、柱后光化学衍生 混合对照品溶液的制备：液体标液 （B1B2G1G2=10.310.3 ug/ml）梯度稀释500倍,供试品溶液的制备：15g粉末，3gNaCl，70%甲醇提取，免疫亲和柱纯化 测定： 吸取混合对照品溶液5l、10l、15l、20l、25l，注入色谱仪，绘制标准曲线。吸取供试品溶液20-25l，测定,方法来源：中国药典2015年版四部通则2351
8、黄曲霉毒素测定法 基本步骤 提取 净化（活化、上样、洗杂、洗脱） 测定 随行质量控制（质控样、随行加样回收）,泵流操作架,免疫亲和柱,HPLC-荧光检测器,光化学衍生器,自动固相萃取仪,净化步骤,取15ml（离心后的提取液），加水至50ml 滤过，取20ml，通过免疫亲和柱，流速3ml/min 加水洗涤两次，每次10ml 过空气10秒，将水挤出柱子 分次加甲醇1.5ml，自然洗脱，过空气，定容至2ml,免疫亲和柱的原理,利用抗原抗体免疫反应的原理，使用大剂量的单克隆抗体，选择性的将样品提取液中的黄曲霉毒素吸附，用水将杂质洗脱除去，再用甲醇定量将黄曲霉毒素洗脱，达到分离净化目的,黄曲霉毒素,单克
9、隆抗体,杂质,黄曲霉毒素的衍生化,衍生原因 黄曲霉毒素B1、G1荧光遇水要淬灭，检测前需要衍生化,药典附录收载的两种衍生方法 碘衍生法：碘作为衍生剂，对衍生温度有要求，试剂对仪器有腐蚀性，需要冲洗 光化学衍生法：紫外光灯（254nm ）照射，操作简单，对衍生温度无要求，不需要其他衍生剂，无需冲洗 对黄曲霉毒素B1和G1进行衍生，黄曲霉毒素B2和G2不受该衍生步骤的影响,AFB1,AFG1,黄曲霉毒素的衍生化,黄曲霉毒素的衍生化,结果报告,低于检测限（标出检测限）,报告具体值,未检出,限度内,限度外,报告具体值,方法难点,痕量分析ppb级，要求高灵敏度 毒性强，具有一定的风险性安全防护措施 基质复杂,注意事项,取样的代表性 黄曲霉毒素在样品中分布不均匀 免疫亲和柱的使用 储存、使用温度（使用说明书） 安全防护 操作人员专门培训，全程穿工作服佩戴手套,注意事项及实验室建议,对照品的使用 使用黄曲霉毒素混合对照品，不使用黄曲霉毒素固体纯品自行配置 对照品贮备液避光、低温、密闭保存，工作液现配现用,试验废弃物处理 残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应泡在专用贮存容器（含10%次氯酸钠溶液内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净） 流动相单独收集，先用次氯酸钠灭毒，再按常规处理,实验室的建议,专门的仪器设备和场所 安全措施 废弃物,谢谢！,
