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1、2019年探究棉花雄性不育进展 1棉花雄性不育的细胞学特征1.1核雄性不育系中的小孢子败育小孢子的发育过程要经过复杂的生理生化变化,在这个过程中,不同发育时期伴随着不同基因的时空表达差异,而这个过程中的任何一个相关基因的突变,都会直接或间接影响小孢子的发育。因此,对于棉花核雄性不育系,小孢子败育会发生在小孢子发育的整个过程,败育时期和特征的差别仅仅因材料而不同。已报道过的棉花核雄性不育系中小孢子败育的时期和特征主要有4种类型:造孢细胞时期:核仁增大、胞质液化、细胞形态畸形。花粉母细胞时期:核仁穿壁,花粉母细胞中有多个核仁,在减数分裂前期后就退化解体,小孢子母细胞呈半月形,如ms8ms9的败育现
2、象10。单核期:胼胝质壁在减数分裂期后就溶解,小孢子外壁不出现刺突,原生质体质壁分离,随后核膜溶解,细胞质和核质解体,如陆地棉1355A(ms2)11和473A(ms14)12不育系。双核期:小孢子产生的生殖细胞紧贴于小孢子内壁,产生的营养细胞与花粉粒原生质体一起皱缩,随后两种细胞都解体,如:ms5ms6不育系13。1.2细胞质雄性不育系中的小孢子败育姚长兵等14对哈克尼西棉细胞质雄性不育系的小孢子母细胞发育过程进行了细胞学研究,发现其可以形成正常的孢原细胞、造孢细胞以及小孢子母细胞,药壁分化正常,但在减数分裂前期,绒毡层提前解体,小孢子母细胞随即退化。由于绒毡层是小孢母细胞的营养源,所以推测
3、棉花细胞质雄性不育系中小孢子母细胞败育可能与绒毡层的提前解体有关。黄晋玲等15发现晋A细胞质雄性不育系败育的主要时期是在造孢细胞增殖期,即小孢子母细胞形成时期,其主要细胞学特征是:造孢细胞胞内常有多个微核,不能进行正常的有丝分裂,小孢子母细胞细胞质液泡化,最终造孢细胞和小孢子母细胞提前退化,因此推测小孢子母细胞的败育与绒毡层的退化密切相关。武小平16对104-7A起源的细胞质雄性不育系P30A小孢子发育进行细胞形态学观察,发现P30A败育主要发生在花粉母细胞形成阶段,其主要的细胞学特征是:孢原细胞分化正常,有大量的初期花粉母细胞产生,但随后花粉母细胞细胞质液泡化,原生质紧缩,核仁消失,最后细胞
4、解体,同时在花药发育的过程中没有明显的绒毡层细胞形成,成熟花药的药室全部充满了破裂的花粉母细胞内含物以及药室内壁物质。上述研究均证明花粉败育与绒毡层细胞发育异常有关。综合以上研究结果,细胞质雄性不育的败育时期多集中在早期,主要是造孢细胞时期和减数分裂时期,造孢细胞时期特征为有丝分裂异常;减数分裂时期特征为花粉母细胞胞质液泡化,随即解体。同时在多个细胞质不育系中观察到绒毡层较早退化,绒毡层作为小孢子发育的营养源,其较早解体必将导致小孢子发育异常。因此,胞质不育较彻底可能与绒毡层提前退化密切相关。2棉花雄性不育的分子机理2.1核雄性不育的分子机理研究比较雄性不育与可育的基因表达差异,是研究核雄性不
5、育分子机理的重要方面。Ma等17对比了棉花ms5ms6双隐性核雄性不育的可育株和不育株的花粉发育过程,发现造孢细胞时期、小孢子母细胞时期和花粉粒时期有17个差异表达片段,分属11种表达模式,可能参与信号转导与能量代谢等相关过程。侯磊等18对洞A雄性不育和可育棉花中花粉发育相关基因的表达进行分析,发现不育和可育花粉cDNA-AFLP的谱带在单核期的差异大于减数分裂期,而在花粉发育早期即花粉母细胞的减数分裂期,不育株中基因的表达减少,而且有些条带虽未消失,但表达量下降了;与可育株相比,随着花粉花药的发育,不育株在花药表型上的异常越来越明显;在花粉成熟期,产生花药中无花粉的现象。根据遗传学和细胞学试
6、验,张天真等19发现陆地棉核不育系1355A的不育性状是ms2单基因控制的,因此1355A是研究核不育的重要材料。随后,王国英等20以1355A为材料,在F2群体中分别构建了可育系与不育系的DNA池,获得了40对(32对SSR、8个SRAP组合)多态性引物。连锁分析显示,3个SSR标记(4个多态性位点)与雄性不育基因紧密连锁。标记BNL3932800和BNL3932870距离ms2分别为1.56cM和2.08cM,位于ms2另一端的BNL236和CIR295遗传距离分别是3.23cM和4.76cM。根据棉花基因组图谱将该基因定位在14号染色体上,从而实现了陆地棉雄性核不育基因ms2的首次精细定
7、位。目前,已克隆到多个参与棉花雄蕊发育或雄蕊特异性表达的核基因。例如,MADS-Box蛋白基因是一类转录因子,在棉花花分化早中期参与雄蕊发育,包括GhMADS121、GhMADS322和GhMADS-1323等,其中GhMADS1编码236个氨基酸,在陆地棉的花瓣、雄蕊、胚珠和纤维中表达,而在根、茎、叶等营养器官和棉花同源异型突变体CHV1(所有花器官均变为苞叶状叶性器官)的变异花蕾中不表达;GhMADS3主要在棉花的雄蕊和心皮中表达;GhMADS-13在棉花花发育早中期表达量逐步增加,后期有下降趋势,同时在雌蕊和雄蕊中表达量较高,推测GhMADS-13可能在开花诱导和花器官发育过程中起着重要
8、作用。20XX年,Wang等24通过荧光定量PCR和Northern杂交实验发现酰基辅酶A合成酶1基因(GhACS1)在棉花雄蕊分化的整个过程都有表达,在花药尤其是绒毡层分化中优势表达,原位杂交实验表明GhACS1在初生造孢细胞、花粉母细胞、小孢子母细胞和绒毡层细胞中表达,GhACS1的活性对于初生造孢细胞、花粉母细胞、小孢子母细胞和绒毡层细胞中脂肪酸代谢起重要作用,抑制该基因的表达会在花药发育早期影响绒毡层发育,进而导致雄性不育,因此GhACS1基因在棉花花药发育早期的小孢子发生过程中起作用,而且可能参与小孢子正常分化与发育。在成熟花粉中还发现特异表达的基因还有多聚半乳糖醛酸酶(polyga
9、lactu-ronase,PG)和第三类过氧化物酶(peroxidase,POD)基因。John等25研究发现PG基因在棉花花药发育后期开始表达,到成熟花粉粒时达到最大量,并且为花粉特异表达基因,表明该基因参与花药发育后期事件,与花粉成熟密切相关。研究还发现棉花中的一个花特异POD基因在花粉中优势表达,可能参与被子植物的雄蕊发育;同时一些棉花中的Class过氧化物酶基因只在花粉中表达,表明它是棉花雄性生殖发育中的胁迫应答因子26。综上所述,花粉发育的过程中表达的基因参与了多个生理生化反应,如激素调节、能量变化和代谢调控等。这些基因的表达具有时空性,有些基因则具有特异性。2.2胞质雄性不育的分子
10、机理研究根据现有研究结果,目前公认的胞质不育形成机制为:一方面胞质中线粒体或叶绿体基因组中的基因发生了突变或分子重排,导致该基因编码的蛋白质不能发挥功能,造成植物不育;另一方面是胞质线粒体基因发生分子重排,其产物影响了线粒体的正常功能,进而花粉发育受阻,最终导致雄性不育。王学德等10以哈克尼西棉细胞质雄性不育系和保持系为研究对象,发现不育系中缺少一条分子质量约为31kDa的多肽片段,线粒体DNA缺少1条1.9kb的片段,该片段与COX1基因具有同源序列,推测胞质雄性不育可能是由于线粒体基因组发生突变或重排,造成COX1基因的变异引起的。黄晋玲27以陆地棉晋A细胞质雄性不育系和保持系为研究对象,
11、也发现在线粒体基因atp6和COX1基因的杂交带中,不育系分别缺少5.7kb和4.2kb的强杂交带。同时,Christine28发现目前至少有14个线粒体基因与细胞质不育有关,它们的共同特征是基因的开放阅读框由已知线粒体基因的编码序列、已知基因的侧翼序列和区域的序列共同组成。蒋培东29研究了哈克尼西棉细胞质雄性不育的机理,推测线粒体中cox基因的突变和线粒体结构异常,导致线粒体呼吸链异常,活性氧清除酶活性和抗氧化酶降低,从而使花药中积累大量的应激活性氧,对细胞发育产生了毒害。黄晋玲27在酶切基因组DNA后发现二者有8个多态性的叶绿体CAPS标记。20XX年,马勇等30以哈克尼西棉细胞质雄性不育
12、系的败育高峰期花粉母细胞减数分裂之前的花药和同型保持系相同时期的花药为材料,利用cDNA-AFLP技术进行差异片段分析,其中差异片段有在不育系中上调(或特异)表达的基因,也有在保持系中上调(或特异)表达的基因,这些差异基因主要参与信号转导、转录、能量代谢、RNA编辑、细胞程序化死亡和雄配子发育等相关过程。因此,通过研究不育系和保持系在叶绿体和线粒体基因组结构、转录和翻译产物方面的差异,证实棉花胞质雄性不育系的形成原因可能存在于线粒体和叶绿体的遗传系统中,尤其是线粒体。由此,张晓等31开发出可鉴定棉花可育胞质与不育胞质的3个分子标记,分别是SSR160、SCAR515和SCAR555。其中SSR
13、160是线粒体基因atpARFLP片段3端的一个SSR位点,在可育胞质中为(TAA)7(TA)6,在哈克尼西棉CMS系(CMS-D2)、陆地棉和海岛棉的不育胞质中是(TAA)3(TA)2,而在三裂棉CMS系(CMS-D8)胞质中是(TAA)4(TA)3;SCAR515和SCAR555是atpA截短型拷贝RFLP片段上可育胞质与不育胞质中分别存在一段515bp和555bp的差异序列,而且这两条差异序列完全不同。由于三裂棉CMS系(CMS-D8)胞质与其他CMS系的差异,张晓等31根据SNP位点,开发出CMS-D8特异分子标记SCARD8。研究细胞质雄性不育系机理的目的,除了寻找不育基因外,还为了
14、研究恢复基因对育性的调控。一般认为,雄性不育系的细胞质中存在不育基因S,而核内则有相对应的一对或一对以上的隐性基因rfrf。而恢复系核中的恢复基因(restoreroffertility,Rf)能抑制CMS的表型,具有使不育恢复为可育的功能。以基因型表示为:不育系为S(rfrf),保持系为N(rfrf),恢复系为S(RfRf)或N(RfRf)。关于棉花细胞质雄性不育的育性恢复机理已取得了一些初步的研究进展。目前,主要通过图位法或者差异分析法进行研究。图位法即通过构建遗传图谱和物理图谱克隆恢复基因。20XX年,Yin等32报道通过构建与恢复基因连锁的遗传图谱和物理图谱,将恢复基因定位在第19号染
15、色体上,物理定位于2个基因组BAC克隆100kb的重叠区域中。20XX年,侯思宇33在(不育系P30A恢复系Y18R)保持系P30B回交群体中发现,子代育性分离比11(不育可育),符合孟德尔遗传规律,这表明育性恢复性状是由一对显性基因控制的;随后以恢复系Y18R为材料构建了与恢复基因连锁的遗传图谱,在图距总长为13.2cM中,STS147标记与恢复基因的遗传距离为0.1cM,同时发现了一个与恢复基因遗传距离为2.4cM的新标记MGH-ES28。以棉花三系为研究材料,也可以通过花发育基因的表达差异分析育性恢复机理。Zhang等34以棉花D8胞质雄性不育系的杂合体(携带有恢复基因)和正常可育(不含
16、有恢复基因)保持系的花药组织为研究对象,使用差异显示技术,发现了一些上调或者下调的基因,推断它们与花药发育相关,并指出恢复基因不是一个花粉特异表达的基因。综上所述,细胞质雄性不育与恢复的机理可归纳为:不育系线粒体的CMS基因改变了线粒体的一些代谢与能量状态,包括呼吸链的改变 1棉花雄性不育的细胞学特征1.1核雄性不育系中的小孢子败育小孢子的发育过程要经过复杂的生理生化变化,在这个过程中,不同发育时期伴随着不同基因的时空表达差异,而这个过程中的任何一个相关基因的突变,都会直接或间接影响小孢子的发育。因此,对于棉花核雄性不育系,小孢子败育会发生在小孢子发育的整个过程,败育时期和特征的差别仅仅因材料而不同。已报道过的棉花核雄性不育系中小孢子败育的时期和特征主要有4种类型:造孢细胞时期:核仁增大、胞质液化、细胞形态畸形。花粉母细胞时期:核仁穿壁,花粉母细胞中有多个核仁,在减数分裂前期后就退化解体,小孢子母细胞呈半月形,
