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1、志贺氏菌及其检验,志贺氏菌 一、生物学特性 1、革兰氏阴性杆菌 2、无荚膜、无鞭毛、 无芽孢，有菌毛 3、需氧或兼性厌氧 4、易于在普通培养基上生长 5、四个亚群,革兰氏阴性鲍氏志贺菌,志贺氏菌的菌毛,二、污染途径,即可产生内毒素，也可产生外毒素，是侵入性细菌 传染源：食物、病人、粪便、苍蝇等 主要污染凉拌菜,（二）临床症状,三、致病性： A、急性细菌性痢疾： 急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢。 B、慢性细菌性痢疾： 慢性迁延型、慢性隐伏型、慢性急性发作型。,四、微生物学检验,（一）检验步骤 检样样品处理增菌培养SS、HE平板分离培养初步生化鉴定最后血清学鉴定报告,1、增菌培养,培养基：G
2、N增菌液 培养条件：361 68h 当培养液出现轻微混浊即中止培养。 操作： 称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以800010000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36培养68h。培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。,2、分离培养,强选择性平板：SS或HE 弱选择性平板：麦康凯或伊红美蓝平板(EMB) 在工作中361培养 1824h， 菌落特征：无色透明，中等大小，光滑圆形菌落,麦康凯琼脂和HE琼脂的区别,两者都选择性生长革兰氏阴性菌。 MacConkey含胆盐及龙
3、胆紫。加了乳糖和中性红来辨别乳糖发酵菌，如果可发酵乳糖，菌落为粉红色，不发酵为透明。 Hektoen enteric 除乳糖发酵外，还可以区分硫化氢。主要用来区分两类细菌：沙门和变形杆菌不发酵乳糖，产硫化氢，黑色克隆；志贺和鼠疫杆菌不发酵乳糖，不产硫化氢，克隆透明。,HE平板原理及反应,发酵乳糖的某种肠杆菌,不发酵乳糖的某种肠道菌，而且产生硫化氢，可能是沙门氏菌,不发酵乳糖的肠道菌，可能就是志贺氏菌,SS平板原理及反应 SS Agar (Salmonella Shigella Agar),大肠杆菌或者别的发酵乳糖的肠杆菌,是沙门氏菌。有黑色中 心。 如果没有黑色中心，就很可能是志贺氏菌了,麦康
4、凯琼脂平板,EMB平板照片及原理,大肠杆菌,3、初步生化试验： 挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36培养1824h，分别观察结果。 原理：本培养基适合于肠杆菌科的鉴定。用于观察细菌对糖的利用和硫化氢（变黑）的产生。该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1，只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。,三糖铁（TSI）琼脂试验的原理,2志贺氏菌 3沙门氏菌 4
5、大肠杆菌,葡萄糖半固体原理及结果。,Organism Test Result 1. Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌）：Motile 2. Staphylococcus aureus：Non-motile 3. Bacillus subtilis：Motile,志贺氏菌生长的结果（现象）： （1）斜面产碱仍为红色或粉红色； （2）底层产酸不产气，变黄色； （3）不产H2S，不出现黑色。 志贺氏菌在半固体培养基生长： 沿线生长，无动力。,下述培养物可以弃去：,a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物； b. 在1824h内发酵乳糖、蔗糖的培养物； c. 不分解葡萄糖和
6、只生长在半固体表面的培物； d. 产气的培养物； e. 有动力的培养物； f. 产生硫化氢的培养物。 凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。,4、血清学试验和生化鉴定试验,4、血清学分型： 凡凝为志贺氏菌，挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。 先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查； 如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。 4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用115各型因子血清检查。 如果鲍氏多价血清
7、不凝集，可用痢疾志贺氏菌312型多价血清及各型因子血清检查。,（2）进一步的生化试验,5、进一步的生化试验： 葡萄糖铵 - 西蒙氏柠檬酸盐 - 赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶 - pH7.2的尿素 - KCN生长 - 水杨苷和七叶苷的分解 -,（3）生化分群,已判定为志贺氏菌属 五项生化试验： 5%乳糖发酵 甘露醇 棉子糖 甘油发酵 靛基质试验,6、结果报告：,综合生化血清学试验结果判定菌群，菌型，并做出报告。,二）其他检测方法,脉冲场凝胶电泳 荧光菌球法 协同凝集试验 PCR法,三）检验操作要点,志贺氏菌在常温中生存的时间较短，应尽快进行试验。 如24h内不能检验，样品应在冰箱内 长时间不能检验，放在
8、低温冰箱内。,致泻大肠埃希氏菌及其检验,致泻大肠埃希氏菌 一、 生物学特性 俗称大肠杆菌 1、革兰氏阴性菌 2、杆状、两端钝圆、周生鞭毛、无荚膜 3、需氧及兼性厌氧 4、能在普通琼脂上生长,普通大肠埃希氏菌Escherichia Coli,扫描照片,二、污染途径,污染水源和土壤，进而污染食物 肉类食品 乳制品 水产品等,三、致病性,肠道内感染 腹泻、食物中毒、肠热症 肠道外感染 鼠疫（烈性传染病）、泌尿道感染、 肺炎、脑膜炎、伤口化脓、败血症,物学检验四、微生,四、微生物学检验,（一）检验步骤 检样样品处理增菌培养伊红美蓝（EMB）平板分离培养生化鉴定血清学鉴定 肠毒素鉴定报告,1、增菌培养,
9、以无菌手续称取检样25 g，加在225 mL营养肉汤中，以均质器打碎1 min或用乳钵加灭菌砂磨碎。 取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN，其余的移入500 mL广口瓶内，于361培养6 h。 挑取1 环，接种于 1管30 mL肠道菌增菌肉汤内，于 42培养 18 h。,2、分离培养,将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板； 污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于361培养1824 h，观察菌落。 不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也 要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。,大肠杆菌在麦康凯琼脂（）的特征,大肠杆菌在麦康凯平板
10、上的典型菌落呈鲜艳的桃红、粉红色.,大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂平板上的特征,EMB培养基，上为E.coli，下为伤寒杆菌,3、生化检验,自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂（TSI）或克氏双糖铁琼脂（KI）。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7.2 尿素琼脂、KCN 肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在 36培养过液。 TSI斜面产酸或不产酸,底层产酸, H2S阴性,氰化钾阴性和尿素酶阴性的培养物为大肠埃希氏菌. TSI底层不产酸或 H2S、氰化钾、尿素有任何一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。 必要时做氧化酶实验或革蓝氏染色镜检。,4、血清学试验 假定试验：挑取
11、经生化试验证实为大肠埃希菌的琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、 侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O 血清和出血性大肠埃希氏菌 O157 血清做玻片凝集试验。 当与某一种多价 O 血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。 致泻大肠埃希氏菌所包括的 O抗原群。如与某一单价 O 血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。,5、肠毒素试验 LT检测方法： 双抗体夹心法 双向琼脂扩散试验 ST 检测方法： 抗原竞争法 乳鼠罐胃试验,1）、双向琼脂扩散试验: 将被检菌按5点环形接种于Elek氏培养基上，以同样操作共做两份，361培养48小时，在每株菌的菌苔上各放一片多粘菌素纸片，36+1经56时，使抗生素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的园并用一滴琼脂垫底。在一份平板的孔内滴加LT抗毒素30ul，另一份平板的孔内滴加ST毒素30ul。放于361经1520小时观察结果，在菌斑和抗毒素之间出现白色沉淀带为阳性，无沉淀带者为阴性。,
