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1、1注射用盐酸头孢甲肟含量测定及有关物质检查方法的研究作者：李群力 刘家健 黄金龙 游莉 施存元【摘要】 目的 用 HPLC 法测定注射用盐酸头孢甲肟中头孢甲肟的含量及有关物质。方法 采用 ODS C18(200mm4.6mm，5m)色谱柱，流动相采用水冰乙酸乙腈(85017150)，流速 1.0ml/min，检测波长 254nm。结果 溶液浓度在 0.06500g/ml 范围内线性良好，r=0.9997(n=12)，方法平均回收率为99.87%，RSD 为 0.36%(n=9)。盐酸头孢甲肟杂质数目为 14 至 15 个，总量为1.001.58%。结论 本法简便、准确、灵敏度高，可用于注射用盐
2、酸头孢甲肟的含量和有关物质检查，亦可以进行稳定性研究中降解产物的色谱检查。 【关键词】 盐酸头孢甲肟 注射液 含量测定 关物质 HPLCDetermination of cefmenoxime hydrochloride for injectionABSTRACT Objective To develop a method for the determination of cefmenoxime hydrochloride for injection and its related substances by HPLC. Method Samples were analyzed on an O
3、DS C18 column with mobile phase of waterglacial acetic acidacetonitrile (85017150) at flow rate 1.0ml/min and detection wavelength of 254nm. Result The standard curves were linear in the range of 0.06500g/ml (r=0.9997). The average recovary was 99.87% (RSD=0.36%). The number of related substances in
4、 cefmenoxime hydrochloride is 1415 and the total amount is 1.00%1.58%. Conclusion The method is simple, accurate and suitable for the determination of cefmenoxime hydrochloride and its related substances. It can also be used to analyzed degradation products in the stability experiments.KEY WORDS Cef
5、menoxime hydrochloride; Injection; Content determination; Related substances; HPLC注射用盐酸头孢甲肟为头孢菌素类抗感染药1 ，是盐酸头孢甲肟加适量助溶剂无菌碳酸钠制成的粉针剂2 。盐酸头孢甲肟为有效成分，对光、湿敏感，其中可能存在的杂质有原料 7 氨基3 (1 甲基1H 四唑5 基)硫甲基头孢烷酸盐酸盐(简称 7ATCAHCl) 、1 甲基5 巯基 四氮唑(简称MMTZ)和 7 氨基 头孢烷酸(简称 7ACA) 等。不考虑采用容量法进行含量测定，而参照美国药典 24 版，选用灵敏度高、专属性强的高效液相色谱法(H
6、PLC)作为2含量测定和有关物质测定方法，以确保本品质量3 。1 仪器与试药1.1 仪器日本岛津公司 LC6A 高效液相色谱仪，附有 SPD6AV 紫外分光光度检测器，CR3A 色谱数据处理机，20l 自动进样阀。1.2 试剂冰乙酸(无锡阳山生化有限责任公司)、乙腈(上海诚心化工有限公司)、磷酸盐(株州市中天磷酸盐化工有限责任公司)，均为 GR 级。1.3 对照品头孢甲肟对照品由中国药品生物制品检定所标定，批号 20030118，头孢甲肟含量 93.5%。1.4 样品注射用盐酸头孢甲肟为自制，每瓶 1.0g，批号 20030203、20030204 和20030205。2 方法和结果2.1 色
7、谱条件Diamonsil C18(200mm4.6mm，5m)色谱柱；流动相为水冰乙酸乙腈(85017150)；流速 1.0ml/min；检测波长 254nm；灵敏度 0.1Aufs；进样体积 20l；理论塔板数以头孢甲肟计不低于 4962。2.2 对照品溶液的制备(1)含量测定 精密称取对照品 10mg，置 50ml 的容量瓶中，加 0.1mol/L pH6.8 的磷酸缓冲液(0.2mol/L 磷酸二氢钾溶液 250ml，加 0.2mol/L 氢氧化钠溶液 118ml，用水稀释至 1000ml，摇匀)2ml 溶解，再加流动相制成每 1ml 中含0.2mg 头孢甲肟的对照品溶液，摇匀，备用。(
8、2)有关物质检查 精密称定供试品 10mg，加 0.1mol/L pH6.8 的磷酸缓冲液 2ml 溶解，再加流动相制成每 1ml 中含 0.2mg 的供试品溶液；另取供试溶液2ml 置 100ml 容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。2.3 供试品溶液的制备3(1)含量测定 精密称取供试品约相当于头孢甲肟 10mg，置 50ml 的容量瓶中，加 0.1mol/LpH6.8 的磷酸缓冲液 2ml 溶解，再加流动相制成每 1ml 中含0.2mg 头孢甲肟的供试品溶液，摇匀。(2)有关物质检查 取本品适量，用流动相配制系列浓度，在盐酸头孢甲肟与相邻杂质达到中国药典 2005 年版二部
9、附录 VD 分离度要求的前提下进行杂质检查供试液浓度的确定试验。结果表明，在 250100g/ml(进样体积 20l)时，检出杂质的个数和百分含量(峰面积)变化不大，因此将 200g/ml 作为有关杂质检查的供试液浓度。2.4 测定方法(1)含量测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 20l，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积(图 1)，按外标法计算。(2)有关物质检查方法 取对照溶液 20l 注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰的高度达记录仪满标度的 10%。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 20l，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的两倍。供试品溶液色谱图
10、中如显杂质，量取各杂质峰面积之和，不得大于对照溶液主峰面积的 1.5 倍(3.0%)。图 1 注射用盐酸头孢甲肟含量测定图谱2.5 标准曲线及线性范围(1)含量测定 精密称取对照品制成浓度分别为 25、50、100、125、250 和500g/ml 的供试液，分别进样 20l，测定。以峰面积(Y)对浓度(X)绘制回归曲线，经回归分析得回归方程：Y=44693.17619X-55001.48582 r=0.9997其浓度在范围 0.06500g/ml 内线性关系良好。最低检出量为0.0012g。 (2)有关物质检查 7ACA 和 MMTZ 用 2ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH6.8)溶
11、解，再用流动相配制并稀释成浓度为 6、3、1.5、0.3、0.15、0.075和 0.038g/ml；7ATCAHCl 用 0.5%碳酸钠超声溶解成 4mg/ml 的溶液，用水稀释成 1mg/1ml 的溶液，再用流动相稀释成上述浓度，分别进样 20l 测定，以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归，7ACA、MMTZ 和 7ATCAHCl 三种杂质的回归方程分别为：Y=235252.50923X-1271.07280 r=0.99994Y=31534.31999X-4501.760778 r=0.9996Y=79457.54682X+3014.548632 r=0.9996试验表明，上述三种杂质
12、的进样量与峰面积的相关性良好，检出灵敏度分别为 0.125、5 和 0.125ng。2.6 稳定性试验为避免溶剂峰的存在造成峰面积百分率计算上的麻烦，选用流动相配制杂质检查用供试品溶液，精密吸取对照品溶液 20l，每隔 30min 进样 20l，测定 Y 值。结果表明本品的供试溶液不稳定，在不到 2h 内杂质含量由 1.00%增加为 1.42%，因此，有关物质检查供试液必须新鲜配制。2.7 精密度试验对同一供试品溶液进行数次测定，按峰面积计算进样精密度试验，同一样品当日数次称量或不同日期称量测定，按百分含量计算进行日内和日间测定方法精密试验，日内精密度、日间精密度的 RSD%分别为 0.42%
13、和 0.71%，表明方法的精密度能满足含量测定要求。2.8 回收率试验按标示量的 80%、100%和 120%计算，精密称定对照品适量，分别加入注射用盐酸头孢甲肟的空白辅料 22mg，分别用流动相稀释至刻度，混匀直接进样20l，按外标法计算回收率。结果见表 1。回收率试验结果表明，空白辅料对其含量测定无干扰。2.9 专属性试验经碱破坏、酸破坏、热破坏、强光照射和 pH6.8 缓冲液中的降解等试验，结果表明头孢甲肟峰与前后相邻杂质峰能完全分离，对本品的含量测定不干扰。2.10 样品含量及有关物质测定结果精密吸取样品溶液 20l，进样测定，盐酸头孢甲肟杂质数目为 14 至 15个，总量为 1.00
14、%1.58%，结果见表 2。表 1 注射用盐酸头孢甲肟回收率试验表 2 样品含量及有关物质测定结果3 小结(1)本文所用的 HPLC 方法可用于盐酸头孢甲肟产品的含量测定(表 2)。5(2)本方法亦可进行盐到头孢甲肟产品的有关物质检查。盐酸头孢甲肟的杂质有三种：原料 7氨基3(1甲基1H四唑5基)硫甲基头孢烷酸盐酸盐、1甲基5巯基四氮唑和 7氨基头孢烷酸，共形成 1415个杂质峰。(3)本方法还能作为本品稳定性研究中降解产物的检查方法。(4)本文所用测定含量和有关物质的 HPLC 方法的检测波长(254nm)和流速(1ml/min)与 USP24 版一致，区别在于 USP24 版所用流动相为水
15、乙腈冰乙酸(50101)，本文所用流动相为水冰乙酸乙腈(85017150)；USP24 版中的理论塔板数以头孢甲肟计不小于 1200，本文则不小于 4962。本方法对国产头孢甲肟的测定更准确，灵敏度更高。(5)本文所用 HPLC 法测定盐酸头孢甲肟的含量，同微生物效价测定法比较，后者测定条件要求较高，测定比较繁琐且准确度差；HPLC 法则方便、准确，精密度高。(6)本研究建立的注射用盐酸头孢甲肟中头孢甲肟含量和有关物质的测定方法，能有效控制成品质量，为成品质量标准的建立提供了依据。【参考文献】1 Stamm J M, Girolami R L, Shipkowitz N L, et al. A
16、ntimicrobial activity of cefmenoxime (SCE1365) J. Antimicrob Agents Chemother,1981,19(2):4542 Huang J L, Ying W, Shi C Y, et al. The preparation process of domestic cefmenoxime hydrochloride J. Chin J Antibioti(中国抗生素杂志),2005,30(7):3963 The United States Pharmacopeial Convention. USP XXIV, NF18 S. 2000:331
