《抗菌药物敏感性试验与耐药检测》由会员分享，可在线阅读，更多相关《抗菌药物敏感性试验与耐药检测（22页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、抗菌药物敏感性试验与耐药检测一、实验目的：一、实验目的：一、实验目的：一、实验目的：1. 1. 掌握纸片扩散法（掌握纸片扩散法（K-BK-B法）的原理、操作方法、结法）的原理、操作方法、结果的判读及临床意义。果的判读及临床意义。2. 2. 了解各种稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作了解各种稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作方法、结果判读和临床意义。方法、结果判读和临床意义。3. 3. 掌握纸片扩散法的质量控制，了解稀释法的质量掌握纸片扩散法的质量控制，了解稀释法的质量控制。控制。二、实验原理二、实验原理 1. 抗菌药物敏感性试验是测定抗生素或其他抗微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力。这种能力可
2、以通过稀释或扩散方法来测定。 1 1）稀释法敏感性试验）稀释法敏感性试验 为了定量测定抗菌药物的活性，抗菌药物与肉汤或为了定量测定抗菌药物的活性，抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合进行稀释，然后种入试验细菌，孵琼脂培养基混合进行稀释，然后种入试验细菌，孵育过夜，能抑制细菌生长的最低浓度称为该制剂的育过夜，能抑制细菌生长的最低浓度称为该制剂的最低抑菌浓度最低抑菌浓度(MIC) (MIC) ，然后将，然后将MIC MIC 与机体血清或体与机体血清或体液中可获得药物浓度相比较，来确定恰当的临床疗液中可获得药物浓度相比较，来确定恰当的临床疗效。效。2 2）纸片扩散法敏感性试验）纸片扩散法敏感性试验 将含有
3、一定量抗菌药物的纸片贴在已接种试验菌将含有一定量抗菌药物的纸片贴在已接种试验菌的琼脂平板上的琼脂平板上，通过纸片上抗生素的扩散形成不，通过纸片上抗生素的扩散形成不同的药物浓度梯度，在距离纸片一定距离的范围同的药物浓度梯度，在距离纸片一定距离的范围内试验菌的生长受到抑制。这种抑制作用与细菌内试验菌的生长受到抑制。这种抑制作用与细菌的敏感性及其他因素相关。的敏感性及其他因素相关。 2.抗菌药物敏感性试验目的：1 1）指导临床医师对各类患者选择最佳抗菌药物。）指导临床医师对各类患者选择最佳抗菌药物。2 2）在一定区域内积累对公共卫生有关的重要耐药的微）在一定区域内积累对公共卫生有关的重要耐药的微生物
4、流行病学资料。生物流行病学资料。3.抗菌药物：抗菌药物： 一一一一般般般般指指指指具具具具有有有有杀杀杀杀菌菌菌菌或或或或抑抑抑抑菌菌菌菌活活活活性性性性的的的的药药药药物物物物，包包包包括括括括各各各各种种种种抗抗抗抗生生生生素素素素、磺磺磺磺胺胺胺胺类类类类、咪咪咪咪唑唑唑唑类类类类、硝硝硝硝基基基基咪咪咪咪唑唑唑唑类类类类、喹喹喹喹诺诺诺诺酮酮酮酮类类类类等化学合成药物。等化学合成药物。等化学合成药物。等化学合成药物。 抗生素类包括抗生素类包括抗生素类包括抗生素类包括: : -内内内内酰酰酰酰胺胺胺胺类类类类（青青青青霉霉霉霉素素素素类类类类、头头头头孢孢孢孢菌菌菌菌素素素素类类类类、头
5、头头头霉霉霉霉素素素素类类类类、亚亚亚亚胺胺胺胺硫硫硫硫霉霉霉霉素素素素、单单单单环环环环内内内内酰酰酰酰胺胺胺胺类类类类及及及及 内内内内酰酰酰酰胺胺胺胺酶酶酶酶抑抑抑抑制制制制剂剂剂剂）、氨氨氨氨基基基基糖糖糖糖苷苷苷苷类类类类、大大大大环环环环内内内内酯酯酯酯类类类类、林林林林可可可可霉霉霉霉素素素素类类类类及及及及四四四四环环环环素类等。素类等。素类等。素类等。内酰胺类：抑制细胞壁合成。内酰胺类：抑制细胞壁合成。青霉素类：青霉素类：青霉素类：青霉素类： 青霉素青霉素青霉素青霉素G G、苯唑西林、阿莫西林、氨苄西林、苯唑西林、阿莫西林、氨苄西林、苯唑西林、阿莫西林、氨苄西林、苯唑西林、阿
6、莫西林、氨苄西林头孢菌素类：头孢菌素类：头孢菌素类：头孢菌素类： 头孢拉定等；头孢呋辛头孢拉定等；头孢呋辛头孢拉定等；头孢呋辛头孢拉定等；头孢呋辛 ；头孢他啶；头孢吡肟；头孢他啶；头孢吡肟；头孢他啶；头孢吡肟；头孢他啶；头孢吡肟其他：其他：其他：其他： 亚胺培南、氨曲南、头孢西丁、氨苄西林亚胺培南、氨曲南、头孢西丁、氨苄西林亚胺培南、氨曲南、头孢西丁、氨苄西林亚胺培南、氨曲南、头孢西丁、氨苄西林/ /舒巴坦舒巴坦舒巴坦舒巴坦 氨基糖苷类：氨基糖苷类： 作用于细菌体内的核糖体，抑制细菌的蛋白质合成作用于细菌体内的核糖体，抑制细菌的蛋白质合成作用于细菌体内的核糖体，抑制细菌的蛋白质合成作用于细菌体
7、内的核糖体，抑制细菌的蛋白质合成的全过程，并破坏细胞膜的完整性。主要作用于的全过程，并破坏细胞膜的完整性。主要作用于的全过程，并破坏细胞膜的完整性。主要作用于的全过程，并破坏细胞膜的完整性。主要作用于G-G-杆菌杆菌杆菌杆菌 ，如链霉素、卡那霉素等，如链霉素、卡那霉素等，如链霉素、卡那霉素等，如链霉素、卡那霉素等大环内酯类：大环内酯类： 通通通通过过过过阻阻阻阻断断断断转转转转肽肽肽肽作作作作用用用用和和和和mRNAmRNA位位位位移移移移而而而而抑抑抑抑制制制制细细细细菌菌菌菌蛋蛋蛋蛋白白白白的的的的合成。主要作用于球菌，如红霉素、麦迪霉素等合成。主要作用于球菌，如红霉素、麦迪霉素等合成。主
8、要作用于球菌，如红霉素、麦迪霉素等合成。主要作用于球菌，如红霉素、麦迪霉素等喹诺酮类：喹诺酮类： 通通通通过过过过拮拮拮拮抗抗抗抗细细细细菌菌菌菌的的的的DNADNA旋旋旋旋转转转转酶酶酶酶，从从从从而而而而阻阻阻阻断断断断细细细细菌菌菌菌DNADNA的的的的复复复复制制制制而而而而产产产产生生生生快快快快速速速速杀杀杀杀菌菌菌菌作作作作用用用用。主主主主要要要要作作作作用用用用于于于于G G- 杆杆杆杆菌菌菌菌，如环丙沙星如环丙沙星如环丙沙星如环丙沙星 、利福平等、利福平等、利福平等、利福平等1 1）敏感：）敏感：）敏感：）敏感： 由由被被测测细细菌菌引引起起的的感感染染，除除禁禁忌忌症症外
9、外，可可用用该该抗抗菌菌药物常用推荐剂量通过恰当治疗而达到治疗目的。药物常用推荐剂量通过恰当治疗而达到治疗目的。2 2）中介：）中介：）中介：）中介： 被测菌株对该药物的被测菌株对该药物的MIC MIC 接近于血液、组织中通常接近于血液、组织中通常可达到的浓度，而治疗反应率可能低于敏感菌株。可达到的浓度，而治疗反应率可能低于敏感菌株。3 3）耐药：）耐药：）耐药：）耐药： 被测菌株不能被该抗生素的常用剂量，在组织内或被测菌株不能被该抗生素的常用剂量，在组织内或血液中达到的浓度所抑制，提示该菌可能存在特定血液中达到的浓度所抑制，提示该菌可能存在特定耐药机制耐药机制( (如产如产-内酰胺酶内酰胺酶
10、) ) ，而且治疗研究表明其，而且治疗研究表明其临床疗效不可靠。临床疗效不可靠。 4.抗菌药物敏感性试验结果判断：原理：原理： 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。无菌生长的透明圈即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，抑菌圈的大
11、小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的并与该药对测试菌的MICMIC呈负相关。呈负相关。 5.纸片扩散法（纸片扩散法（Kirby-Bauer法）法） （1 1）分类：）分类： 琼脂稀释法、肉汤稀释法、微量稀释法琼脂稀释法、肉汤稀释法、微量稀释法（2 2）原理：）原理： 用水解酪蛋白（用水解酪蛋白（用水解酪蛋白（用水解酪蛋白（MHMH）培养基将抗生素作不同浓度）培养基将抗生素作不同浓度）培养基将抗生素作不同浓度）培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后接种待测细菌，定量测定抗菌药物对被的稀释，然后接种待测细菌，定量测定抗菌药物对被的稀释，然后接种待测细菌，定量测定抗菌药物对被的稀释，然
12、后接种待测细菌，定量测定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度测菌的最低抑菌浓度测菌的最低抑菌浓度测菌的最低抑菌浓度(MIC)(MIC)或最低杀菌浓度（或最低杀菌浓度（或最低杀菌浓度（或最低杀菌浓度（MBCMBC）。）。）。）。6.6.稀释法稀释法 （3）微量液体稀释法微量液体稀释法原理： 聚乙烯板内含有各种稀释度的抗菌药物，实验时聚乙烯板内含有各种稀释度的抗菌药物，实验时每孔加入每孔加入100l100l浓度为浓度为10105 5 CFU/ml CFU/ml的菌液，盖上盖板，的菌液，盖上盖板，3737孵育孵育161620h20h观察结果。孔底部清晰不出现细菌沉观察结果。孔底部清晰不出现细菌沉淀的最低抗
13、菌药物浓度即为该抗菌药物对细菌的最小淀的最低抗菌药物浓度即为该抗菌药物对细菌的最小抑菌浓度，通过抑菌浓度，通过CLSICLSI标准判断其敏感和耐药。标准判断其敏感和耐药。7. E7. E7. E7. E试验试验试验试验 是一种结合稀释法和扩散法原理对微生物药敏试验直接定量是一种结合稀释法和扩散法原理对微生物药敏试验直接定量是一种结合稀释法和扩散法原理对微生物药敏试验直接定量是一种结合稀释法和扩散法原理对微生物药敏试验直接定量的技术。的技术。的技术。的技术。原原原原理理理理： E E试试条条是是一一条条5mm50mm5mm50mm无无孔孔试试剂剂载载体体，一一面面固固定定有有一一系系列列预预先先
14、制制备备的的浓浓度度呈呈连连续续指指数数增增长长稀稀释释抗抗菌菌药药物物，另另一一面面有有读读数数和和判判别别的的刻刻度度。抗抗菌菌药药物物的的梯梯度度可可覆覆盖盖有有2020个个MICMIC对对倍倍稀稀释释浓浓度度的的宽宽度度范范围围。将将E E试试条条放放在在细细菌菌接接种种过过的的琼琼脂脂平平板板上上，经经孵孵育育过过夜夜，围围绕绕试试条条明明显显可可见见椭椭圆圆形形抑抑菌菌圈圈，圈圈的的边边缘缘与与试试条条交交点点的的刻刻度度浓浓度度即即为为抗抗菌菌药药物物抑抑制制细细菌菌的的最最小小抑抑菌菌浓浓度度，对对照照CLSICLSI标准判断其敏感、耐药、中介。标准判断其敏感、耐药、中介。 8
15、. 8.联合药物敏感试验联合药物敏感试验联合药物敏感试验联合药物敏感试验1 1）方法很多，其中纸片法最为常用。先将试验菌均）方法很多，其中纸片法最为常用。先将试验菌均）方法很多，其中纸片法最为常用。先将试验菌均）方法很多，其中纸片法最为常用。先将试验菌均匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置5 5分钟，待分钟，待分钟，待分钟，待平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板上，
16、两纸片中心距离上，两纸片中心距离上，两纸片中心距离上，两纸片中心距离2-4mm2-4mm左右。然后左右。然后左右。然后左右。然后3535 孵育孵育孵育孵育过夜，取出观察结果。过夜，取出观察结果。过夜，取出观察结果。过夜，取出观察结果。2 2）结果判断）结果判断）结果判断）结果判断联合药物敏感试验可出现四种结果：联合药物敏感试验可出现四种结果：联合药物敏感试验可出现四种结果：联合药物敏感试验可出现四种结果：A.A.无关作用：无关作用：无关作用：无关作用： 甲甲甲甲+ +乙乙乙乙= =甲单或乙单甲单或乙单甲单或乙单甲单或乙单B.B.拮抗作用：拮抗作用：拮抗作用：拮抗作用： 甲甲甲甲+ +乙甲单或乙
17、单乙甲单或乙单乙甲单或乙单乙甲单或乙单C.C.相加作用：相加作用：相加作用：相加作用： 甲甲甲甲+ +乙乙乙乙= =甲单甲单甲单甲单+ +乙单乙单乙单乙单D.D.协同作用：协同作用：协同作用：协同作用： 甲甲甲甲+ +乙甲单乙甲单乙甲单乙甲单+ +乙单乙单乙单乙单三、实验操作步骤三、实验操作步骤三、实验操作步骤三、实验操作步骤（一）（一）（一）（一）纸片扩散法：纸片扩散法：1. M-H1. M-H平板：直径为平板：直径为90mm90mm，厚度，厚度 4mm 4mm。2. 2. 菌悬液制备：无菌挑取菌落于无菌生理盐水中，校菌悬液制备：无菌挑取菌落于无菌生理盐水中，校 正浊度至正浊度至0.5 0.
18、5 麦氏。麦氏。3. 3. 用无菌棉签浸入细菌悬液中，将棉签在试管壁上轻用无菌棉签浸入细菌悬液中，将棉签在试管壁上轻 轻挤压以挤去过多的菌液，用棉签以连续划线的方轻挤压以挤去过多的菌液，用棉签以连续划线的方式均匀涂抹琼脂平板表面三次（每次转式均匀涂抹琼脂平板表面三次（每次转6060）使）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。盖上菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。盖上平板的盖子，放置平板的盖子，放置310min310min。 4.4.用无菌镊子将抗菌纸片粘贴于用无菌镊子将抗菌纸片粘贴于M-HM-H琼脂的表面，一琼脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中心距离应大于旦纸片贴上，不能移动
19、；各抗菌纸片中心距离应大于 24mm 24mm，纸片距平板内缘应大于，纸片距平板内缘应大于15mm15mm。（滤纸直径为（滤纸直径为（滤纸直径为（滤纸直径为6.35mm6.35mm，-20-20保存，使用前放置室温平衡。）保存，使用前放置室温平衡。）保存，使用前放置室温平衡。）保存，使用前放置室温平衡。）5. 375. 37孵育孵育161624h24h6. 6. 量取抑菌环直径，根据量取抑菌环直径，根据CLSICLSI标准，报告细菌对该抗标准，报告细菌对该抗生素敏感生素敏感(S)(S)、耐药、耐药(R)(R)、中介、中介(I)(I)。 （二）液体微量稀释法（二）液体微量稀释法（二）液体微量稀释
20、法（二）液体微量稀释法1. 1.菌液稀释：菌液稀释： 将已稀释好的将已稀释好的0.50.5麦氏的待测菌做麦氏的待测菌做200200倍稀释；倍稀释；2.2.抗生素稀释：抗生素稀释： 取无菌离心管取无菌离心管1111支，每管加入支，每管加入250ul M-H250ul M-H液体培养基，液体培养基，在第在第1 1孔内加入浓度为孔内加入浓度为5120ug/ml5120ug/ml的抗生素的抗生素250ul250ul，混匀；吸取混匀；吸取250ul250ul此液体至第此液体至第2 2孔中，混匀；依次倍孔中，混匀；依次倍比稀释至第比稀释至第1111孔孔. .3.3.每人取无菌聚苯乙烯板条一条，共每人取无菌
21、聚苯乙烯板条一条，共1212孔；第孔；第1-111-11孔孔每孔加入每孔加入100ul100ul加抗生素，第加抗生素，第1212孔加孔加100ulM-H100ulM-H液液体，做对照；体，做对照；4.4.每个孔加入每个孔加入100ul100ul浓度为浓度为10105 5菌悬液（大肠或金葡）菌悬液（大肠或金葡），混匀，胶布封口，混匀，胶布封口，37C37C培养。培养。 5.5.观察浊度，凡孔底清晰或不出现细菌沉淀的最低观察浊度，凡孔底清晰或不出现细菌沉淀的最低药物浓度即为该抗生素对被测菌的最低抑菌浓度药物浓度即为该抗生素对被测菌的最低抑菌浓度（MICMIC）。）。四、四、四、四、 结果判断及临床
22、意义结果判断及临床意义结果判断及临床意义结果判断及临床意义n n敏感n n中介n n耐药最小抑菌浓度最小抑菌浓度最小抑菌浓度最小抑菌浓度(MIC) (MIC) (MIC) (MIC) ： 可完全抑制细菌增长的最低药物浓度。可完全抑制细菌增长的最低药物浓度。最低杀菌浓度最低杀菌浓度最低杀菌浓度最低杀菌浓度(MBC)(MBC)(MBC)(MBC)： 杀死杀死99.999.9的供试微生物所需的最低药物浓度。的供试微生物所需的最低药物浓度。 如果受试药物对供试微生物的如果受试药物对供试微生物的如果受试药物对供试微生物的如果受试药物对供试微生物的MBCMBCMBCMBC大于或等于大于或等于大于或等于大于
23、或等于32323232倍的倍的倍的倍的MICMICMICMIC，可判，可判，可判，可判定耐药。定耐药。定耐药。定耐药。 五、质量控制：五、质量控制：每每批批或或每每次次实实验验时时应应根根据据测测试试菌菌种种类类分分别别选选用用标标准准菌株在同一试验条件下进行测定。菌株在同一试验条件下进行测定。 如：金黄色葡萄球菌如：金黄色葡萄球菌ATCC25923 大肠埃希菌大肠埃希菌ATCC25922 粪肠球菌粪肠球菌ATCC29212 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌ATCC27853等等六、影响因素：六、影响因素：1. 培养基：培养基：厚度，厚度，PH，离子浓度，成份，添加剂；，离子浓度，成份，添加剂；2. 抗菌药物的配制方法，抗菌药物的配制方法，纸片的含量，大小，纸片的含量，大小， 渗透性，保存方式等；渗透性，保存方式等；3. 细菌的接种量；细菌的接种量；4. 培养的环境，温度与时间；培养的环境，温度与时间；5. 结果的判断及解释标准结果的判断及解释标准等。等。
