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1、苹果酸的酶法制备一、苹果酸的酶法制备（一）苹果酸生产1、苹果酸生产机理L-苹果酸在生物体中普遍存在，它作为三羧酸循环的一员而参与细胞代谢。在一般生物中它只参与循环而不会大量积累，否则会造成代谢流的阻塞。要想积累苹果酸，必须要有补充4碳酸的途径。理论上讲，补充4碳酸的途径有两条：乙醛酸循环和丙酮酸羧化支路。2、苹果酸生产用微生物不同的苹果酸发酵工艺要采用不同的微生物。一步法发酵工艺采用的微生物有黄曲霉、米曲霉和寄生曲菌；两步法及混合发酵法采用的有华根霉、无根根霉、短乳杆霉、膜醭毕赤酵母等；酶法转化有短乳杆菌、大肠杆菌、产氨短杆菌和黄色短杆菌等。3、苹果酸发酵工艺L-苹果酸的发酵工艺大体可以分为三
2、类：一步发酵法、两步发酵法和酶法转化。一步发酵又称为直接发酵，它用糖类为原料，用霉菌直接发酵产生苹果酸。两步发酵法也是用糖类为原料，先由根霉发酵成富马酸（或富马酸-苹果酸混合物），再由酵母或细菌转化成苹果酸。酶法转化是用富马酸（盐）或马来酸为原料，用微生物酶（包括全细胞）转化成苹果酸。发酵方法利用了微生物酶的立体异构专一性，生产的都是L-苹果酸，是生物体内所存在和可以利用的构型。（一）酶法转化工艺酶法转化工艺相当于两步发酵工艺中的转换发酵。转换发酵是将第一步发酵生成的富马酸转化成苹果酸；而酶法转化是用富马酸盐（一般是化学合成的）为原料，利用微生物的富马酸酶转化成苹果酸（盐）。如果转化是以钙盐的
3、形式进行的，则称为“转晶”，即富马酸钙晶体转化成苹果酸钙晶体。 延胡索酸酶 +H2O 延胡索酸（反丁烯二酸） 苹果酸（2羟基丁二酸）富马酸酶活力短乳杆菌和德氏乳杆菌较好。短乳杆菌在等体积的麦芽汁和肉汤加l0 g/LCaCO3的培养基，于pH 6和37培养3天，作为富马酸酶的来源。上述用干细胞作为酶制剂的效果虽然很好，但从实际生产观点出发，如果不需要分离细菌细胞，而将底物直接加入短乳杆菌培养液中将是更为方便和经济适用的。（二）固定化细胞转化工艺富马酸向L-苹果酸的转化只牵涉一步酶催化反应，因此只要把富马酸酶提取出来，固定到载体上，就可以利用固相酶反应柱连续生产L-苹果酸。但实际上酶的提纯手续复杂
4、，酶的回收率低，成本高。固定细胞法与固定酶法相比，具有下述优点：A、不需要进行酶的抽提和纯化；B、与酶提纯过程相比，细胞固定过程中酶活力的保存率较高；C、酶的光学活性较高；D、成本低但是，固定化细胞的缺点是有副反应存在，特别是易于生成琥珀酸，这在产品中很难与苹果酸分离。幸运的是，细胞固定之后采用一些化学试剂处理可以排除上述副反应。1、产氨短杆菌细胞固定与苹果酸生产产氨短杆菌是用于固定化细胞生产L-苹果酸的最好菌种之一，下面以产氨短杆菌为例介绍固定化细胞生产方法。产氨短杆菌培养基（%）：葡萄糖 2 富马酸0.5玉米浆 1 尿素 0.2KH2PO4 0.2 MgSO47H2O 0.05pH7.0细
5、胞在30，好氧培养2024h后，用高速离心机收离菌体，再将细胞悬浮于生理盐水中，再用聚丙烯酰胺凝胶包埋，方法如下：对于16mL悬浮液，加入丙烯酰胺3g，N，N-甲叉丙烯酰胺0.16g，5%-二甲基胺丙腈水溶液2mL及1%过硫酸钾水溶液2.0mL，于25静置10min。将形成的凝胶切成3mm大小的小块。这种制备好的固定细胞直接使用会有副反应，产生琥珀酸，它在产品中很难与苹果酸分离。工业上，胆汁处理法最为适用。将固定化产氨短杆菌凝胶块装到酶反应柱中进行连续操作的情况下，当lmo1/Ll的富马酸钠溶液（pH7.0）以0.25h-的稀释速率流过反应柱时，在37 稳定状态下约有80%富马酸转化成了L-苹
6、果酸。固定化细胞反应柱的富马酸酶稳定性与操作温度有关。采用37操作温度，反应柱的半衰期约为55天。2、黄色短杆菌细胞固定与苹果酸生产黄色短杆菌等富马酸酶活力较高。上述细菌细胞用卡拉胶固定效果更好。卡拉胶也称角叉菜胶，固定方法如下：8g（湿重）黄色短杆菌细胞悬浮在8mL生理盐水（45）中，将1.5g卡拉胶溶在34mL生理盐水中，两者在约50混合，冷至约l0维持30min。为了增加凝胶强度，再将它浸在250mLl0.3mol/L的KCl溶液中，在10维持4 h。这样处理以后，用刀将形成的较坚硬凝胶切成3mm大小的小块。为了增加富马酸酶活力和抑制琥珀酸生成，固定后的凝胶块要用含0.3%胆汁和1mol
7、/L富马酸钠的溶液，于37下静浸20h。3、酵母细胞固定与苹果酸生产（1）材料活化的酵母细胞、0.05%的CaCl2溶液、海藻酸钠溶液。（2）操作步骤1）海藻酸钠溶液配制取0.7g海藻酸钠，放入50ml小烧杯中，加入10ml水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全融化，用蒸馏水定容至10ml。（注意：加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，知道海藻酸钠溶化为止。）2）海藻酸钠溶液与酵母细胞混合将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，在转移至注射器中。3）固定化酵母细胞以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加到配置好的CaCl2溶液中
8、，观察液滴在CaCl2溶液中形成的凝胶珠的情形。将这些凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。4）用固定化酵母细胞进行转化生产将固定好的酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗23次。将转化底物配制成一定的溶液，移到三角瓶中，在加入固定好的酵母细胞，封口，转化24h。（三）苹果酸的提取和精制1、苹果酸的提取通常也采用钙盐法进行提取。2、苹果酸的精制苹果酸的精制一般采用离子交换和活性炭联合处理法。3、苹果酸结晶对于含杂质很少的高纯度苹果酸溶液：只要茬低于70下减压浓缩，使浓度达到6580%，再冷却到20，添加晶种，就能获得高纯度苹果酸结晶。苹果酸晶体的干燥要求在真空条件下进行，温度控制在4050。干燥
9、后要立即包装，不能长期暴露在湿空气中，否则它易于吸潮而潮解，尤其是L-苹果酸更易潮解。二、苹果酸的检测（一）定性检验1、三氯化钛法在试管中加入约5mL待试溶液，滴入3滴15%TiCl3溶液，在几分钟内出现白色沉淀，表明有苹果酸存在。如果气温太低，可将试管握在手中温热，但不能在灯焰上加热，因为煮沸时柠檬酸溶液也有类似反应，生成白色沉淀。这种方法也可以定性草酸，因为草酸溶液在这种情况下显示典型的黄色。这种方法苹果酸的最低检出浓度为0.5g/L。在有其他有机酸、无机酸或糖存在时，最低检出浓度有所变化。2、美国药典法取样约5g，溶解于lmL lmol/L硫酸中，加lmL0.0003%的2-萘酚硫酸溶液
10、，混匀。溶液具有蓝色荧光，透射光呈淡黄色。3纸层析法取新华5号层析滤纸，裁成1520cm。点样线距底边2cm，点样间距2cm，点样量2L。展开剂：正丁醇：85%甲酸：水=5：5：l。展开剂平衡3h，然后放入点好样的滤纸，按上行法展开，展开时间约需3h。显色剂：0.2%溴甲酚绿喷雾，有机酸显黄色斑点。也可以用混合显色剂（0.2%溴甲酚绿：0.05%甲基红：0.5mol/1NaOH=l：1：0.15）喷雾显色，有机酸呈桔红色斑点，很明显。各种酸的Rf值见表3-1。控制纸层析斑点圆正度的关键除了正确选择滤纸和展开剂外，还要控制展开剂的平衡时间。采用本方法时，平衡时间以3h为宜。时间过短斑点横向扩散，
11、过长则纵向扩散，甚至拖尾。展开剂配制好后存放8l0h以上已经出现分层现象，不再能使用。（二）定量检验1、酸碱滴定法取约2g苹果酸，精密称定。在一只三角瓶中溶于40mL新沸过的冷水中，加入酚酞指示剂，用lmol/LNaOH滴定至开始出现粉红色（持续时间不低于30s）。lmL lmol/LNaOH溶液相当于67.04mg C4H6O5。2、紫外分光光度法试剂：（1）硫酸96%，分析纯，不含硝酸盐。（2）2，7-萘二酚溶液：lg 2，7-萘二酚溶于l00mL96%硫酸中。操作：取lmL样品溶液（苹果酸浓度控制在0.050.8mg/L）加入6mL试剂（1）中，加入0.1 mL试剂（2），在100下水浴加热1520rain，冷至接近室温后，在385nm紫外光下比色测定。同时以空白水样同法处理，作仪器调零之用。用纸层析定性后的样品，将显色斑点剪下，用lmL水洗脱，也可采用此法测定。根据上述在385nm下测得的吸光度值，可以从标准曲线上查得苹果酸含量。
