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1、 1 Western blot protocol 第一部分第一部分：样品制备样品制备 （一） 、所需试剂： 1. Western 及 IP 细胞裂解液(KGP701)： Western 及 IP 细胞裂解液分装后存于 -20冰箱中，避免反复冻融； 2. PMSF（100mM）：sigma； 3. PBS （二） 、所需耗材： 离心管、细胞刮、各种规格的枪头 （三） 、所需仪器： 各种量程的移液器、4高速离心机 （四） 、操作步骤： 1在每 mL 冷 Western 及 IP 细胞裂解液加入 10L 100mM PMSF，混匀。冰上 保存数分钟待用； 2. 倒掉已处理好的细胞的培养液，预冷的 P
2、BS 冲洗两次，每次振摇数次以尽量 去除培养液，将培养瓶置于冰上； 3. 加入上述适量配制好的 Western 及 IP 细胞裂解液（107个细胞加入 Western 及 IP 细胞裂解液 1 mL2 mL），用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触； 4. 裂解完毕后，迅速用细胞刮将细胞刮于培养瓶一侧（动作须块） ，然后用枪将 细胞碎片和裂解液转移至 1.5ml EP 管中（操作在冰上进行），10000 转/分，4 离心 5 min（离心机需要预冷）； 5. 取上清转移至新的预冷的离心管中，蛋白定量（BCA 法）； 第二部分：第二部分：测定蛋白浓度测定蛋白浓度 （一） 、所需试剂： 凯基 BCA
3、 蛋白含量检测试剂盒（KGPBCA） ，分装后存于-20冰箱中，避 免反复冻融。 （二） 、所需耗材： Ep 管、96 孔板、离心管、细胞刮、各种规格的枪头 2 （三） 、所需仪器： 各种量程的移液器、振荡器、37烤箱、酶标仪 （四） 、操作步骤： 1. 根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B(50:1)配制适量 BCA 工作液，充分混匀； 2. 取一块 96 孔板，按照下表加入试剂： 孔号 0 1 2 3 4 5 6 7 样品 1 蛋白标准溶液（L） 0 1 2 4 8 12 16 20 去离子水（L） 20 19 18 16 12 8 4 0 19
4、样品 1 对应蛋白含量（g） 0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 BCA 工作液（L） 200 200 200 200 200 200 200 200 200 3. 把 96 孔板放在振荡器上振荡 30sec，37放置 30min，然后在 562nm 下比色 测定。以蛋白含量（g）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线； 4. 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为 20L，以标准曲线 0 号管 做参比，在 562nm 波长下比色，记录吸光值； 5. 根据标准曲线计算样品实际浓度（单位：g/l） ，将所有样品浓度用裂解液调 至 4g/l； 6. 分装保存于-80
5、,避免反复冻融。 第三部分第三部分：Western bloting （一） 、所需试剂： 1. 30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺 29.2g，甲叉双丙烯酰胺 0.8g，加水至 100ml， 棕色瓶 4保存。 2. 1.5mol/L Tris-HCl 分离胶缓冲液 pH8.8(4x)：取 18.15g Tris，用 1N HCl 调 pH 至 8.8，加水至 100ml，4保存。 3. 1mol/L Tris-HCl 分离胶缓冲液 pH6.8(4x)：取 12.114g Tris，用 1N HCl 调 pH 至 6.8，加水至 100ml，4保存。 4. 电泳缓冲液 (pH8.3)： 取 14.49
6、g 甘氨酸， 3.02g Tris， 1g SDS or 100ml 10% SDS， 加水至 1 升，4保存。 3 5. 转印缓冲液：取 14.49g 甘氨酸，3.02g Tris，200ml 甲醇（最后加） ，加水至 1 升，常温保存。 6. 1xTBST：取 8.766g 氯化钠，6.058g Tris，用 HCl 调 PH 值至 7.6，最后加 0.5mlTween20，加水至 1 升，常温保存。 7. 10%APS: 过硫酸铵 0.1g，加 ddH2O 1ml，-20保存。 8. 5%封闭液：脱脂奶粉 2g，加 TBST 40ml，现用现配。 9. 5xSDS 上样缓冲液、甲醛、脱脂
7、奶粉、一抗、二抗、PVDF 膜、ECL 发光液等。 （二） 、所需耗材： Ep 管、各种规格的枪头、镊子、塑料板、离心管等。 （三） 、所需仪器： 各种量程的移液器、电磁炉、水平摇床、封口机、冰箱、制冰机、电泳设备 一套、电转设备一套。 （四） 、操作步骤： 1、SDS-PAGE 电泳电泳 1.1. 预先清洗电泳玻璃板，晾干； 1.2. 玻璃板对齐后放入夹中卡紧，准备灌胶（对齐夹紧，以免漏胶） ； 1.3. 根据蛋白大小制备分离胶（PH8.8） ：灌分离胶时，可用 1ml 枪加入胶（直接 倒也可） ， 预留 1.5cm 高度配制浓缩胶 （距梳子下缘 1 厘米） 。 加入去离子水压线， 液封，室
8、温放置 0.5-1hr 左右至聚合完全（具体见附表） ； 1.4. 胶凝固（当去离子水和胶之间有一条折线时）后，倒去胶上层的去离子水， 并用吸水纸吸干； 1.5. 制备 4%浓缩胶（PH6.8） ：制备浓缩胶，将剩余空间灌满浓缩胶之后，插入 梳子，凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻拔出。凝胶时间约 0.5-1hr （具体见附表） ； 1.6. 放入电泳槽（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，槽的另一 面要垫一块塑料板且有字的一面向外） ， 用电泳缓冲液冲洗一下浓缩胶的样品孔； 1.7. 将蛋白 5-15ul（蛋白上样量 30-50ug）与 5xSDS 上样缓冲液按 4：1 混
9、合， 加入 EP 管（尖底 EP 管，封口膜封好）中，沸水煮 3-5min 使蛋白完全变性后， 立即置于冰上； 4 1.8. 电泳，90V 至蛋白 marker 分出条带（约半小时） ，转至 120V 至溴酚蓝刚跑 出即可终止电泳（60-90min） ； 2、转膜转膜 2.1. 从玻璃板上卸下凝胶，将凝胶浸入转印缓冲液中； 2.2. 将滤纸、海绵垫浸入转印缓冲液中； 2.3. 将剪好并做好记号的 PVDF 膜浸入甲醇中 5min，再浸入转印缓冲液中（需 测量 PVDF 膜面积） ； 2.4. 打开半干转印仪的上盖，在平板中间铺五层预先用转印液浸透的滤纸，铺上 PVDF 膜（膜与滤纸大小一致，位
10、置一致） ； 2.5. 切胶，胶的大小与膜的大小一致，盖于滤纸上。在胶上覆上五层滤纸。整个 操作在转印缓冲液中进行，不能有气泡（转印液含有甲醇，操作时要带手套，实 验室要开门使空气流通） ； 2.6. 盖上半干转印仪的上盖， 接通电源， 按照 PVDF 膜面积计算所用电流大小及 转印时间（仪器说明书上有说明） ； 3、免疫反应免疫反应 3.1. 转膜结束后，将膜转移至含有封闭液的孵育盒中，室温下，在脱色摇床上摇 动封闭 1-2h 或者 4 度过夜； 3.2. 将一抗用封闭液稀释至适当浓度，脱色摇床 37 度孵育 2h 后（或 4过夜） ， 用 TBST 在室温下脱色摇床上洗 3 次，每次 5m
11、in； 3.3. 将二抗用封闭液稀释至适当浓度，脱色摇床 37 度孵育 1-2h 后，用 TBST 在 室温下脱色摇床上洗 3 次，每次 5min； 4、ECL 化学发光显影化学发光显影 4.1. 将膜平铺于 western 发光仪器中，正面向上，将 ECL kit 中 A 和 B 液在离心 管中等体积混合后，将溶液平铺于膜蛋白表面； 4.2. 仪器显影。 5 说明： 根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制 SDS-PAGE 的分离胶(即下层胶)： 不同浓度的 SDS-PAGE 分离胶的最佳分离范围： SDS-PAGE 分离胶浓度 最佳分离范围 6%胶 50-150k
12、D 8%胶 30-90kD 10%胶 20-80kD 12%胶 12-60kD 15%胶 10-40kD 我们常用的分离胶和浓缩胶（我们常用的分离胶和浓缩胶（ml） 试剂（ml） 10%分离胶（ml） 4%浓缩胶（ml） 蒸馏水 3.17 5.9 6.38 3.4 5.5 6.8 Acrylamide/bis 2.67 5 5.3 0.83 1.3 1.7 1.5mol/L Tris-HCl （PH8.8） 2.0 3.8 4.0 0 0 0 1mol/L Tris-HCl （PH6.8） 0 0 0 0.63 1.0 1.25 10%SDS 0.08 0.15 0.16 0.05 0.08 0.1 10%APS 0.08 0.15 0.16 0.05 0.08 0.1 TEMED 0.0032 0.006 0.0064 0.005 0.008 0.01 总体积总体积（ml） 8 15 16 5 8 10 适用玻璃板数适用玻璃板数 2 块块 4 块块 2 块块 4 块块
