dna甲基化检测常见问题-欧易生物

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1、 DNA 甲基化检测甲基化检测 常见问题常见问题 上海欧易生物 技术支持部 1 DNA 甲基化检测甲基化检测常见问题常见问题 目目 录录 1. DNA 甲基化高通量检测手段如此多样，在具体的研究项目中该如何进行选 择？ 2 2. MeDIP-seq 文库构建方法？ . 2 3. MeDIP-Seq 是否一定要测 input 组？Input 组具体用在哪里？ 2 4. MeDIP-Seq 测多少数据量足够？ 2 5. MeDIP-seq 需要设置生物学重复吗？ . 2 6. 哪些因素会影响 MeDIP-Seq 结果的质量？ . 2 7. Bisulfite-Seq 需要多大的测序量？ 3 8.

2、如何保证 Bisulfite 对 DNA 处理的完全性？ 3 9. BS-seq 需要设置生物学重复吗？ 3 10. 哪些因素会影响甲基化检测结果？ 3 11. Methyl-RAD-seq 的测序数据量如何计算？基因组太大做这个技术成本太高 怎么办？ 3 12. Methyl-RAD-seq 测序序列很短，仅有 30bp 左右，如何确定差异甲基化片段 在基因组位置，如何进行后期的验证分析？ 4 13. Methyl-RAD-seq 的重复性怎么样？ . 4 14. Unique mapping 率如何？ 4 15. MethylRAD 能检测到多大比例的 CpG 位点？ 4 16. Meth

3、ylRAD 理论上只测序甲基化片段，如何排除检测的假阳性？ . 5 17. 针对 MethylRAD 检测到的某个甲基化位点的甲基化水平，能否利用焦磷酸 测序或 BSP 等手段进行验证出来？ 5 2 DNA 甲基化检测甲基化检测常见问题常见问题 1. DNA 甲基化甲基化高通量高通量检测手段检测手段如此如此多样，在具体的研究项目中多样，在具体的研究项目中该该如何进行选如何进行选 择？择？ 基因组整体水平甲基化检测可以通过 Illumina 850K 芯片、 MeDIP-Seq、 Methyl-RAD-seq 以及 Bistlfite-Seq 进行研究，而 Illumina 850K 芯片目前只

4、适用于人类样本的 DNA 甲基化水 平检测。Illumina 850K 芯片、Bistlfite-Seq 和 MethylRAD-seq 能精确到单个碱基的甲基化水 平，而 MeDIP-Seq 检测只能精确到 50bp 片段。MeDIP-Seq 和 Bistlfite-Seq 只适用于有参考 基因组物种的甲基化检测，而 MethylRAD-seq 对于有参考基因组和无参考基因组的物种均 适用。 2. MeDIP-seq 文库构建方法？文库构建方法？ 通过使用 5-甲基胞嘧啶抗体富集高甲基化的 DNA 片段，并结合 Solexa 高通量测序平 台进行甲基化测序，首先需要对所富集的 DNA 片段进

5、行前处理，构建测序文库。其方法如 下： （1） 对富集的双链 DNA 进行末端修复； （2） 将“A”碱基加入到 DNA 片段的 3末端；（3） 使用特定的测序接头连接 DNA 片段两端； （4）纯化连接产物； （5）高保真聚合酶 PCR 扩 增连上接头的 DNA 片段； （6）检测测序文库。 3. MeDIP-Seq 是否一定要测是否一定要测 input 组？组？Input 组具体用在哪里？组具体用在哪里？ 条件允许的情况下，一定要测 Input 组。Input 组主要用在 Peak Calling 环节，进行基于 local possion 模型的比较，判断 IP 组检测到的 peak 是

6、否显著富集。 4. MeDIP-Seq 测多少数据量足够？测多少数据量足够？ 不同物种不同条件下甲基化位点分布和信号总和不同， 因此所需的 Reads 数目也是不同 的。根据经验总结，达到饱和测序深度的安全数据量如下： 果蝇/线虫：5M 条（对）Reads 水稻/大豆/短柄草：10M-20M 条（对）Reads 哺乳动物：30M-40M 条（对）Reads 如遇其他物种，可以选择 1.5-2基因组的数据量。 Input 至少和 IP 组持平，越多越好。 5. MeDIP-seq 需要设置生物学重复吗？需要设置生物学重复吗？ 条件允许情况下，建议设置 3 个重复。可根据重复样本的信息，判别 Pe

7、ak 真实性，进 一步加强差异甲基化区段挑选准确性。 6. 哪些因素会影响哪些因素会影响 MeDIP-Seq 结果的质量？结果的质量？ 由于进行 DNA 甲基化测序前，需要对样品进行 DNA 免疫沉淀富集，富集过程中反应 条件是否合适，直接影响到富集甲基化 DNA 的量，另外还需要保证处理过程中测序样品无 3 污染，否则会严重影响测序结果的质量；DNA 免疫沉淀富集后，如果 DNA 的量过少，需 要进行 PCR 扩增，PCR 过程会产生偏差，影响样本甲基化结果的分析。 7. Bisulfite-Seq 需要多大的测序量？需要多大的测序量？ 每个样本至少需要进行 10基因组的测序量，推荐覆盖 3

8、0以上。 8. 如何如何保证保证 Bisulfite 对对 DNA 处理的完全性？处理的完全性？ 目前我们建立了标准实验流程，确保 Bisulfite 对 DNA 的处理达到生物信息分析要求。 我们的标准实验流程是在以标准品DNA和H19等基因位点的多个质量控制步骤下进行严格 控制的。 9. BS-seq 需要设置生物学重复吗？需要设置生物学重复吗？ 生物学变异是始终存在于产生的各样本数据中， 这种变异可能会影响到我们作出合理的 判断。如下图所示，三条蓝色的曲线代表三个正常样本中特定区域的甲基化水平，三条红色 的曲线代表处理样本中相应区域的甲基化水平。 假如我们每组只测定一个样本， 如图中加粗

9、 的蓝色曲线和加粗的红色曲线， 可以看到仅凭这两个样本， 很显然会将该区域划定为一个差 异甲基化区域， 但实际上当我们考虑所有生物学重复样本时， 该区段在两组样本中并未有线 组合的差异甲基化。 10. 哪些因素会影响甲基化哪些因素会影响甲基化检测检测结果？结果？ 样品 DNA 长度，Bisulfite 处理过程，测序深度，测序质量等都会影响到最终的结果。 11. Methyl-RAD-seq 的测序数据量如何计算？的测序数据量如何计算？基因组太大做这个技术成本太高基因组太大做这个技术成本太高 怎么办？怎么办？ 建议每 G 基因组对应 30M Reads。如果是无参考基因组并未对基因组大小有一定

10、评估 的物种，可以参照该物种的近缘物种基因组；如果基因组太大，可以根据老师的经费情况， 选择部分标签进行测序。 选择原理：基因组 DNA 经过酶切后，所产生的酶切片段为 3端突出 3 个碱基的粘性末 端。在对酶切片段连接接头的过程中，如果接头的粘性末端 3 个碱基为 NNN，则可以将所 有酶切片段回收。但如果接头的粘性末端 3 个碱基中存在一个选择性碱基，比如 NNA，理 论上就可以将标签数量降到总标签数量的 1/4；如果采用兼并碱基，比如 NNR，理论上就可 以将标签数量降到总标签数量的 1/2。 4 12. Methyl-RAD-seq 测序序列很短，仅有测序序列很短，仅有 30bp 左右

11、，如何确定差异甲基化片段左右，如何确定差异甲基化片段 在基因组位置，如何进行后期的验证分析？在基因组位置，如何进行后期的验证分析？ 针对无参考基因组物种， 没有办法将差异甲基化片段定位到基因组上， 后期对差异甲基 化片段进行验证， 可以采用如下方法： A） 比对到近缘基因组； B） 进行基因组 survey 测序， 然后比对；C）chromosome walking。 如果是有参考基因组物种， 是可以实现基因组位置定位的， 定位后可以获得片段上下游 序列信息，比较便于后面的特异位点甲基化分析。 13. Methyl-RAD-seq 的重复性怎么样？的重复性怎么样？ MethylRAD 技术文章

12、中对拟南芥的幼苗组织进行了两次技术重复，CCGG 和 CCWGG 位点两次技术重复 R2 在 0.95 以上，MethylRAD 技术重复性是非常好的。 14. Unique mapping 率率如何如何？ 从生物学角度而言， 基因组上重复区域一般是发生高甲基化的， 所以来源于重复区域的 序列比对回基因组的时候就会存在非 unique mapping。 不同物种 unique mapping 率有差别，一般在 3060%。以拟南芥为例，MethylRAD 获得 的序列 unique mapping 率为 34.5%-36.1%，WGBS 所获得序列的 unique mapping 率为 38%

13、-43%，水平相当。具体结果可以参考 MethylRAD 技术文章。 15. MethylRAD 能能检测到多检测到多大大比例的比例的 CpG 位点位点？ MethylRAD 技术文章中有拟南芥中 MethylRAD 和 WGBS 检测位点的对比图，可以看 5 到二者检出吻合度非常高，如下： （三行分别对应：基因组上预测出来的、WGBS 检测到的、MethylRAD 检测到的 CCGG 位点） （三行分别对应：基因组上预测出来的、WGBS 检测到的、MethylRAD 检测到的 CCWGG 位点） 除了 CmCGG、CmCWGG，利用 FspEI 酶的 MethylRAD 技术还可以识别到其他

14、八种类 型的甲基化位点： TmCGG、 AmCGGG、 AmCTGA、 AmCTGC、 TmCAGC、 GmCAGC、 TmCTG、 mCTGT。 16. MethylRAD 理论上只测序甲基化片段，如何排除检测的假阳性？理论上只测序甲基化片段，如何排除检测的假阳性？ 对于植物样品而言，可以用叶绿体作为阴参（理论上叶绿体不发生甲基化） ，评估测序 的假阳性率水平。 17. 针对针对 MethylRAD 检测到的某个甲基化位点的甲基化水平，能否利用焦磷酸检测到的某个甲基化位点的甲基化水平，能否利用焦磷酸 测序或测序或 BSP 等手段进行验证出来？等手段进行验证出来？ MethylRAD 技术适用于进行样品间差异甲基化位点的筛选，因此如果是两组样品间差 异的甲基化位点，可以通过焦磷酸测序或 BSP 等手段验证出来； 但如果是对甲基化位点的绝对水平进行验证，不能保证验证结果，因为 MethylRAD 技术无 法实现甲基化水平的绝对定量，只能相对定量。 6 联系联系我们：我们： 公司公司总部总部：上海市浦东新区祖冲之路 1505 弄 138 号 6 楼 服务热线：服务热线：4006-4008-26 欧易官网：欧易官网： 市场联络邮箱：市场联络邮箱： 技术服务咨询邮箱：技术服务咨询邮箱： 邮编：邮编：201210 微信：微信：