分析化学第17章色谱分析概论

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1、第十七章 色谱分析法概论 chromatography,色谱法是最重要的分离技术，篇幅约占书的三分之一,色谱法概述 色谱过程和术语 色谱法基本理论 基本类型色谱的分离机制,第一节 色谱法概述,一、色谱法（chromatograph）的起源和发展 11906年由俄国植物学家Tsweet创立 植物色素分离见图示 2、1931年胡萝卜素异构体的分离 3、3040年代TLC、PC平板色谱法的出现 4、40年代瑞典科学家Tiselius等在分配液相色谱、 吸附色谱和电泳领域取得了成果 5、50年代英国Martin和Synge建立GC色谱 6、60年代GC-MS联用 7、70年代HPLC崛起,图示,固定相

2、CaCO3颗粒 流动相石油醚 色谱柱玻璃柱,植物色素混合物,Chroma + to + graph,2现在：一种重要的分离、分析技术 分离混合物各组分并加以分析 固定相除了固体，还可以是液体 流动相液体或气体 色谱柱各种材质和尺寸 被分离组分不再仅局限于有色物质,色谱学的重要作用,应用的科学领域：生命科学、材料科学、环境科学等 药学： 1、教材内容多，约占全书的三分之一。 2、药学各个专业都会用到色谱分析法 药典 2005年版 2000年版 部 药品 1967种 1699种 HPLC分析 848种 567种 3、考研 大综合包括分析、有机、生理、生化 其中分析75分约近一半是色谱内容,二、色谱

3、法定义、分离基础和目的,定义：利用各组分物理化学性质的不同，在流动相流 经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分 配或其它亲和力的差异而产生不同速度的移 动，最终达到分离的目的。图例 分离基础：差速迁移 (例:赛跑) 目的：多组分分离，实现定性定量分析,图示,分离机制： 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离,吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分开,碳酸钙 吸附剂,石油醚 流动相,色素,三、色谱法分类： 1按两相的态分：,Mobile phase stationary phase Liquid Solid L-S色谱 LC Liquid Liquid

4、 L-L色谱 Gas Solid G-S色谱 GC Gas Liquid G-L色谱,2按固定相的固定方式分：,吸附色谱：利用物理吸附性能的差异（固定相固体） absorption chromatography L-S（液固吸附法） G-S （气固吸附法） 分配色谱：利用分配系数的不同（固定相液体） partition chromatography L-L（液液分配附法） G-L（气液分配附法） 离子交换色谱：利用离子交换原理（固定相离子交换树脂） ion exchange chromatography 空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同（固定相凝胶） size exclusion chrom

5、atography,3按分离机制分：,色谱法简单分类,四、色谱法的特点,优点：“三高”、“一快”、“一广”,缺点：,第二节 色谱过程与术语,一、色谱过程 二、基本术语,1、流出曲线和色谱峰 2、基线、噪音和漂移 3、峰宽柱效参数 4、峰高和峰面积定量参数 5、保留值定性参数 6、分配系数和容量因子相平衡参数 7、分离因子和分离度分离参数 8、等温线,一、色谱过程,色谱过程：指物质分子（被分离组分）在相对运动的 两相（流动相和固定相）中的“分配”平衡过程,以吸附色谱为例见图示 色谱过程： 吸附 解吸再吸附 再解吸 反复多次洗脱被测组分分配系数不同 差速迁移 分离,图示,吸附能力弱的组分先流出 吸

6、附能力强的组分后流出,组分的结构和性质微小差异 与固定相作用差异 随流动相移动的速度不等 差速迁移 色谱分离。,二、基本术语,1流出曲线和色谱峰,流出曲线（色谱图 chromagtogram）：电信号强 度随时间变化曲线 色谱峰(peak)：流出曲线上突起部分,包括：定性参数、定量参数、柱效参数、分离参数等,2基线、噪音和漂移 base line, noise and drift,基线：仅有流动相通过检测器时产生 的信号曲线。反映检测器噪音 随时间变化的曲线 （稳定平直直线） 噪音：仪器本身所固有的，以噪音 带表示（仪器越好，噪音越小） 漂移：基线向某个方向稳定移动 （仪器未稳定造成）,3峰宽

7、 peak width：色谱柱效参数,峰宽W：色谱峰两侧拐点切 线与基线相交的截距,标准差：为正态分布曲线两拐点间距离的一半。对应 0.607h处峰宽的一半 注：小，峰窄，柱效高 半峰宽W1/2：峰高一半处所对应的峰宽,注：除了用于衡量柱效， 还可以计算峰面积,峰高(peak height；h)：组分在柱后出现浓度 极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的 距离。 峰面积(peak area；A)：色谱曲线与基线间 包围的面积。,4峰高和峰面积：色谱定量参数,5保留值：色谱定性参数,保留时间 retention time, tR：从进样开始到组分出现浓度极大点时所需时间，即组分通过色谱柱所需要的时

8、间 死时间dead time, t0：不被固定相滞留组分的保留时间，相当于流动相到达检测器所需要的时间,调整保留时间tR：组分由于和固定相作用，比不作用的组分在柱种多停留的时间，即组分在固定相中滞留的时间。等于组分的保留时间与死时间之差值,表示组分在色谱固定相内滞留状态的参数,（1）时间表示的保留值,图示,续前,保留体积VR：从进样开始到组分出现浓度极大点时所需要的 流动相的体积。 VR与tR和Fc（流动相流速mL/min）的关系,死体积V0：由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间 体积。包括从进样器到色谱柱导管的体积、固定相的孔隙及颗 粒间隙、 柱出口导管及检测器内腔体积的总和。,（2

9、）用体积表示的保留值,续前,调整保留体积VR：保留体积与死体积之差，即组分 停留在固定相时所消耗流动相的体积,V0 和 Vm、t0 和 tm 的区别,V0 ：由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间体积 ； 流定相充满死体积所需的时间为t0 。 Vm ：平衡时流动相在色谱柱中占有的体积，流动相经过色谱柱所需时间用tm 表示。 Vm V0，tm t0 的物理意义有区别。在多数情况下，可忽略导管和检测器内腔的容积，Vm 和 V0视为近似相等。,6分配系数和容量因子：相平衡参数,1）分配系数K（partition coefficient , 平衡常数） 定义：指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中

10、达分配 平衡后，在固定相与流动相中的浓度比,与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关 实验条件固定，K仅与组分性质有关,不同分离机理的色谱中，K名称虽有所不同，但物理意义都 一样，表示平衡状态下两相中浓度之比 分配系数K不容易获得，不常用,K为热力学常数,2）容量因子（capacity factor, 容量比，分配比）k： 定义：在平衡状态下，组分在固定相与流动相中的质量比 相当于组分被固定相滞留的时间和流动相通过系统所需时间比,分配系数和保留时间是本质与现象关系,组分 吸附力 Cs K tR VR B 强 大 大 长 大 A 弱 小 小 短 小,3）保留行为和分配系数关系（P442）,色

11、谱过程方程：,应选择合适分离条件使得难分离的组分K不等,2）色谱条件（s，m，T）一定时，K一定 tR一定,1）K或k的影响因素：固定相、流动相和柱温,结论：K 或k不等是分离的前提,例：分离A、B两组分,7.分离因子和分离度：分离参数 描述相邻组分分离状态的指标,（1）分离因子（分配系数比或选择性系数） 定义：两种物质调整保留值之比,分离因子1是色谱分离的必需条件,（2）分离度（resolution, R）：衡量分离条件优劣的参数 定义：相临两组分间峰顶间距离是峰底宽平均值的几倍,讨论,设色谱峰为正常峰，W1W2= 4,8、等温线,定义：指一定温度下，组分在两相中分配达平衡时，在两相 中的浓

12、度关系曲线，即cs对cm的关系曲线 图示,(1) 线性等温线（理想）对称峰 (2)非线性等温线 凸形拖尾峰（常见） 凹形前沿峰,固定相表面活性吸附中心未达饱和，K一定，与溶质浓度无关,固定相表面吸附中心活性不均，溶质分子先占据强吸附中心再 占据弱吸附中心，K随着溶质浓度的增加而减小,溶质与固定相作用，改变其表面性质，K随着溶质浓度的增加 而增加,斜率=K,线性：对称峰,凹形：前沿峰,凸形：拖尾峰,低浓度为正常峰,对称因子：（拖尾因子）,fs在0.951.05之间,fs小于0.95,fs大于1.05,3）对称因子(symmetry factor) 衡量色谱峰对称性,第二节 色谱过程与术语,一、色

13、谱过程 二、基本术语,1、流出曲线和色谱峰 2、基线、噪音和漂移 3、峰宽柱效参数 4、峰高和峰面积定量参数 5、保留值定性参数 6、分配系数和容量因子相平衡参数 7、分离因子和分离度分离参数 8、等温线,第三节 色谱法基本理论,要使R大，必须： 1、tR大- k大-热力学 2、W小-峰展宽小-动力学,分离度：,色谱理论包括两方面: 热力学理论：研究分配(分离)过程，塔板理论（plate theory） 动力学理论：研究各种动力学因素对峰展宽的影响，速率理 论（rate theory）。,一、塔板理论 plate theory,始于马丁（Martin）和辛格（Synge）提出的塔板模型。 分馏

14、塔：在塔板上多次气液平衡，按沸点不同而分离。,色谱柱每个H高度内有一块塔板，共有若干块塔板。组分在每块塔板两相间分配达平衡，K小的先出柱。多次分配平衡，K有微小差异组分仍可获较好分离,假想：,（一）塔板理论的四个基本假设,1柱的组成为多个连续、等距塔板，每塔板内组分分配瞬间达 平衡（H理论塔板高度） 2流动相间歇式进入色谱柱，每次进一个塔板体积 3样品和载气均加在第1号塔板上，沿柱方向纵向扩散忽略 4分配系数在各塔板上是常数,结果：当塔板数很大时，组分色谱流出曲线为趋于正态分布,（二）理论板数和理论塔板高度,L ：柱长,色谱柱效参数,有效理论塔板数和有效理论塔板高度,理论塔板数和理论塔板高度,

15、塔板理论的贡献：从热力学角度,解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大点的位置 提出了评价柱效高低的n和H的计算式,须在给定条件，指定组分测定时才有意义 缺点：,1.柱效不能表示被分离组分的实际分离效果。 2.塔板理论无法解释同一色谱柱在不同流动相流速下柱效不同的 结果，无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。,练习,例： GC法，柱长为2m，固定相5%的OV-17、柱温为1250C，记录纸速度为2.0cm/min的色谱条件下，测定萘的保留时间为2.35min，半峰宽为0.20cm，求理论塔板数和板高。若用甲烷测得死时间为0.20min，求有效理论塔板数和板高。（见书上P444例）,解：,二、速率理论 rate theory,塔板理论成功处： 解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大值对应的tR 评价柱效（n，）,塔板理论存在问题: 1）做出了四个与实际不相符的假设 忽略了组分在两相中传质和扩散的动力学过程 2）只定性给出塔板高度的概念，却无法解释板高的 影响因素 3）排除了一个重要参数流动相的线速度u， 因而无法解