微生物检测-防腐效能试验

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1、微生物检测四、防腐效能试验防腐效能试验又称“挑战性试验” ，它是用来测定防腐剂有效抗菌的最低浓度，所有的化妆品在生产和消费者使用过程中都面临着受到微生物污染的可能。因此在化妆品中常添加不同种类的防腐剂来防止微生物的大量繁殖。大多数的化妆品不能认为是无菌产品，因为制造它们的原材料不是无菌的，在生产过程中没有采用无菌程序，没有灭菌过程，而且常常装在多次使用过的包装容器内，这就可能造成了微生物的污染。产品中细菌、酵母菌、霉菌的生长依赖于产品中适于微生物生长的营养成分和物理化学因素，包括水分活度（a） 、产品中的营养素、储存的温度、防腐剂的存在等。当有足够的水分和营养成分存在时，液体产品除非有适宜的防

2、腐剂存在，否则微生物将会迅速繁殖，化妆品中防腐剂的存在减少了液体化妆品中微生物生长和脱水化妆品中微生物存在的几率。脱水产品如矿物油、眼影、粉底等在反复使用过程中都有被污染的可能；但是由于它们没有微生物生长所必需的水分，因此微生物的繁殖速率相对较低。产品的微生物污染是多种多样的，最严重的微生物污染是致病性微生物的污染，如致病性微生物金黄色葡萄球菌或条件致病性微生物绿脓杆菌或白色念珠菌的污染，在消费者的使用过程中就会对消费者造成极大的危害。非致病性微生物的污染一般不会对消费者造成生命威胁，然而很高浓度的微生物的污染如达到 10 的五次方个 ml，会引起产品的变质（在颜色、气味、香味、透明度等方面）

3、 ，导致产品不能使用。（一）防腐效能试验的必要性使用污染了的产品会给消费者造成健康威胁。防腐剂的作用在于对化妆品制造过程和消费者使用过程中的微生物污染进行预防，防腐效能试验就是在产品配方的确定中测定防腐剂能起到防腐作用的防腐剂的最低浓度。有许多试验的标准可以评估一个产品的配方是否具有有效的防腐效能。产品中加入防腐剂量的多少非常重要，因为（1）防腐剂的量添加太少，会使微生物繁殖而引起污染；（2）防腐剂的量太大，会引起皮肤不适（如产 生皮疹、灼烧、皮肤变红、发痒等）或过敏；（3）防腐剂使用过量会使产品成本增加，这无疑会加重消费者负担、通过防腐效能试验，可以选择既能有效抑菌又可以使产品安全、稳定，且

4、使用起来愉快舒适的化妆品中防腐剂的最低浓度。（二）防腐效能试验方法要点目前化妆品生产制造企业或研究机构所使用的防腐检测方法主要有 CTFA、ASTM（美国检验方法及材料协会） ，USP（美国药典）和英国药物学方法；我国使用中华人民共和国化妆品微生物标准检验方法（GB7978.1-87） 。另外，还有快速检测法，如线性回归法和加速防腐试验方法。上述试验具有一些相同的特性，如：测试的微生物种类和恢复系统、测定 APC 方法均相同。这些方法的主要区别在于培养温度、接种物的制备程序和培养时间的不同。这些方法的不同导致了试验结果的差异和执行标准的不同，但在具体使用任何一种方法时，都应有适当的有效性统计学

5、方法加以支持，以使方法更有效、更准确。上述方法各具优点，当然，美国分析化学家协会 AoAc 正在根据上述方法寻找一种新的更实用的方法。综合以上各种方法，进行防腐效能测试应考虑以下几个方面：（1）检验所用的时间；（2）方法的可靠性；（3）使用统计学方法处理数据的可靠性；（4）被检测产品的类型；（5）被测试的微生物种类；（6）使用纯培养或混合培养物；（7）配方中其他抗菌剂的协同效应；（8）成功的标准。（三）检测方法1.CFFA 方法列出了用于化妆品防腐效能试验中的常用微生物，其中包括了与眼部有联系的细菌，这些细菌是从眼部区域天然存在的微生物区系，或从临床上分离出来的，或从污染的产品中分离获得的。防

6、腐效能试验中常用的细菌培养基包括 NA、TSA(水解大豆琼脂培养基） 、EA(琼脂培养基） 。适宜于真菌生长的培养基包括SDA(糊精琼脂培养基） 、PDA(马铃薯琼脂培养基） 或 MA(琼脂培养基） 。当菌体生长好后，可将细菌或酵母菌于 5下斜面保存，霉菌可在室温下斜面保存。每隔一定时间（一周或一个月）进行传代来保持菌种的生存，但频繁传代会使菌种的某些特性丢失或减弱微生物的抗性，冷藏或冷冻干燥保存微生物是一种取代斜面保存的方法，因为它克服了频繁传代的缺点，保证了遗传性状的稳定性。还应注意的是在没有选择压力的情况下由于频繁传代抗性更易丧失。在含有防腐剂的化妆品中分离出来的微生物，可能仍然保留着对

7、防腐剂的抵抗力。在准备接种物时，可以用肉汤或琼脂培养基培养细菌和酵母菌，收获的菌体用于微生物检验。在进行微生物检验时，一般取 20g 或 20ml 样品，微生物的接种浓度控制在 110cfu 细菌 ml（或 g）产品，或110cfu 酵母菌 ml（或 g）产品。为了获得每种或每一类群微生物的试验数据，CTFA 倾向于使用纯培养物或相当类似的微生物来接种，体积不应超过总体积的 1%，这些检验水平提供了比通常消费者使用可能性更高的细菌污染机会。加之，在产品设计时许多产品还有保护性体系，即加入略多一些的防腐剂，因此，大多数经检验后确定的防腐剂浓度保证了产品可以在消费者使用期间抵抗污染，而且比它们的一

8、般要求严格得多。样品一旦接种，实验人员就会将其与被测产品彻底混合，同时，取出样品在适宜的中和性肉汤中稀释，从而使防腐剂失去效力。大多数方法采用 1g 或 1ml 混合物倾注平板培养。有些实验室使用选择性平板涂布方法来估计微生物的数量。那些对温度敏感的微生物则可采用涂布的方法、一般来讲细菌的培养温度为 32-35真菌采用 25-30培养。多数试验方法（CTFA,USP,ASTM 等）推荐混合测试的样品分别于 0、1、2、3 天（仅用于眼部的化妆品） 、7、14 和 28 天观察微生物的生长情况。有些检验可能多于 28 天，这依赖于其所期望的使用范围。有些产品还进行重复性的防腐试验来估计防腐剂在产

9、品中的适应性，用某一特定的微生物防腐试验可以得出使防腐系统失去效力所需的检验次数。CTFA 所推荐的含有中和剂的稀释培养基有：LBL,LBLT,TGB 或 WB.当使用倾注平板法培养时，加入培养基中的卵磷脂或吐温 80 就可以中和绝大多数的防腐剂，并使产品均匀分布，对细菌、酵母和真菌来讲，letheen.琼脂培养基是最常使用的培养基，这种培养基还适用于厌氧菌的生长，对于中和季铵盐类化合物十分有效。其他的 CTFA 推荐的培养基有：TSA（大豆酪蛋白水解物培养基） ，NA（营养琼脂） ，TA(硫代乙醇酸琼酯） ，混合琼脂（ 脑、心、小牛肉的混合物） ，EA，TGYEA(胰胨 B 葡萄糖 B 酵母

10、提取物琼脂） ，TCG-YEA(胰蛋白酶水解物 B 葡萄糖 B 酵母提取物琼脂，D-E 培养基，以及 TSAPL(含卵磷脂和吐温 80 的胰蛋白酶大豆水解琼脂） ；其他还有使真菌富集的培养基，如右旋葡萄糖琼脂，Mycophil 琼脂，Mycological 琼脂和 Eugon-gar。当划线培养时，中和剂和琼脂培养基相混，多数使用的是 lb 琼脂培养基，如果防腐剂是汞或其他重金属，则应采用硫代乙醇酸的培养基。2.ASTM 法这种方法主要应用于对经防腐和未经防腐样品的比较检验。ASTM 提供了一系列可使用的微生物。这种方法使用的细菌保存在营养琼脂培养基上，酵母菌和丝状真菌保存在 Mycophil

11、 琼脂培养基上，培养温度分别为 32和 25，菌种每月转接一次。试验所使用的菌体必须是新鲜的，即细菌在适当的培养基上于 37培养 24h-48h，酵母在 25下培养 48h，丝状真菌在 25下培养 7 天-14 天（至产生池子） 。这种方法要求在接种细菌时用无菌接种环将微生物转移到无菌蒸馏水中，在 425nm 下控制浓度为 110 的 8 次方细菌 mll。在接种霉菌时，用接种环或无菌玻璃棒轻轻接触霉菌培养物将孢子取出，然后用无菌的不吸水的棉花过滤除去菌丝体，并打散抱子，再用血球计数器控制孢子在 110 的次方个 ml 的水平。ASTM方法取样时将待测样品以 100g 为一份，取 3 份装入带

12、有玻璃珠的容器中。每份样品加入 lm 的微生物悬浮液（菌液的最终浓度为 110 的 6 次方细菌 ml 或 110 的 8 次方酵母 ml，混合后的样品于室温下保存，在适当的时间（0，7，14，28 天）取一份混合样与 9 份 Letheeb 肉汤混合，采用 10 倍稀释溶液，倾注法进行菌落计数，培养时间和温度同前，最后以第一平板上的菌落数，得到每克检验产品的存活的微生物数目。有时化妆品会反复受到暴露或污染。在这种情况下，ASTM 方法建议在 28 天后再进行防腐试验，这种重复检验，可以对消费者使用过程中产品污染的潜在问题作出更好的预测。例如，它对确定手和身体用清洗液的污染和频繁使用的睫毛膏的

13、污染都很重要。重复防腐性检验或再培养可以显示某种特定产品的防腐系统失效前，产品能经受住多大的损害。ASTM 要求 G-和 G+细菌和酵母菌，在防腐性检验后 7 天内至少降低 99.9%。本试验的后期微生物不应有什么增长，真菌在 28 天内应降低 90&，并且试验期间不应该出现增长现象，未经防腐的样品在这两项指标方面都不合格。ASTM 是通过在平板上观察被测菌有无生长的现象，来检验培养基对防腐剂的中和效果的。具体做法是：用经混合接种的营养肉汤的培养物以 10 的-1 次方、10 的-2 次方和 10 的-3 次方的菌浓度进行平板划线。这种混合接种物可以是 G-、G+及酵母，或是丝状真菌混合物，在

14、 32培养 18h-24h，或25培养 72h 后无生长的现象就表明没有对杀菌剂起中和作用。3.USP XX方法列出了本方法所检验的微生物。USP 方法采用的是 SCDA(大豆酪蛋白消化性琼脂培养基） ，因为它可以使微生物旺盛地生长。故 USP 方法建议用此培养基来活化菌种和富集培养基。将保存的菌种在固体培养基上接种。细菌的培养在 c 毫下培养 18h-24h，酵母菌在 20-25下培养 48h，丝状真菌在 20-25下培养一周，然后用无菌生理盐水收集细菌和酵母菌体，并将其稀释到 1 千万细胞/ml，丝状真菌用含0.05%吐温 80 的无菌水收集并将孢子浓度调至 1 千万个/ml。由于菌悬液的

15、浓度决定了试验中的接种量，因此，应控制好菌液的浓度。另外，菌悬液制备好后应立即使用，否则将影响菌悬液中菌体的存活性。当产品的包装容器不能进行接种和无菌取样时，应取 20ml 的产品至一个无菌的带盖的细菌试管中，以0.01ml 的接种液：20ml 试验样品的比例进行接种，接种液中的微生物浓度应控制在 1105-1106 细胞/ml 之间，接种后在 20-25下培养，微生物的计数采用平板计数法来确定。以这个数来计算产品中的初始菌体浓度。并于第 7，14，28 天分别进行检测，并计算 APC（efu/ml） ，试验者可根据初始菌体浓度，计算出 APC 的变化。根据这种方法，一种有效的防腐体系可以在

16、14 天后将细菌生存数减至初始浓度的0.1%，酵母和霉菌生存水平可能会更低。在试验后期阶段，必须低于或维持这些既定的水平。4.检验方法的比较比较了上述三种方法，它们在设计和应用上是相似的，这些方法的主要区别在于接种物的不同（ 纯培养或混合培养） 和培养方法的区别（ 倾注法或涂布法） 。这种区别会给结果造成一定的差异，但在具体使用任何一种方法时，都应有适当的有效性鉴定作为支持，有效性鉴定包括接种物存活力、抗防腐剂能力以及防腐检测试验中稀释剂的影响及微生物的恢复等。USP 法应用于原始未开封的，以水为基质或载体的，用于耳、鼻、眼部的产品中真菌的检测；CTFA 方法是大多数企业防腐性能检测中使用的方法，特别是将化妆品分为劣、中、优等保藏时，CTFA 方法具有特别的意义。多数生产者所作的防腐性能检测试验应比普通微生物检测试验使用更宽的试验微生物范围，从而使产品有更大的安全空间。研究表明，大多数生产者所做的防腐检测试验真实地模仿了产品在消费者使用或误用的范围内所受到的微生物浸染状况。他们把产品涂在消费者