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1、 泸州市科技计划项目申报书项目名称：(川大-泸州) microRNA在肺炎链球菌诱导宿主天然免疫中的作用项目领域：医疗卫生申报单位(盖章)：泸州医学院附属医院项目负责人：黄远帅归口部门：西南医科大学附属医院项目起止年限：2014年1月 - 2016年12月填报时间：2013年12月8日泸州市科学技术局制(2012版)项目名称(川大-泸州) microRNA在肺炎链球菌诱导宿主天然免疫中的作用第一承担单位单位名称泸州医学院附属医院通讯地址泸州市太平街25号邮政编码646000单位负责人何延政联系人黄远帅联系人电话15808307577联系人手机15808307577职工人数1958上级行政主管部
2、门泸州市科技局单位性质其他单位经济类型国有企业特性上年度企业财务状况(单位：万元，仅限企业填写)资产总额负债总额固定资产原值其中流动负债固定资产净值销售收入总额流动资产其中主营业务收入纳税总额所有者权益总额净利润总额其中实收资本项目负责人姓名黄远帅性别男年龄35电话15808307577学历博士生学位博士职称副研究员职务副主任从事专业临床检验诊断学所在单位泸州医学院附属医院项目协作单位序号单位名称在本项目中的分工1四川大学华西医院miRNA作用靶点的验证23456项目组人数8高级3中级1初级2其他2主要研究人员姓名性别年龄学历职务(职称)从事专业所在单位邓正华男45本科副主任技师临床检验诊断学
3、泸州医学院附属医院黄熙女32博士生住院医师眼科学四川大学华西医院温先勇男49本科副主任技师临床检验诊断学泸州医学院附属医院彭瑛女36本科主管技师临床检验诊断学泸州医学院附属医院田刚男29研究生技师临床检验诊断学泸州医学院附属医院王洁女25研究生在读研究生临床检验诊断学泸州医学院附属医院王雨涵女24研究生在读研究生临床检验诊断学泸州医学院附属医院项目简介以肺炎链球菌感染小鼠、诱导小鼠天然免疫应答，芯片筛选不同时相中天然免疫相关的miRNA，预测miRNA作用靶点并鉴定，以确定天然免疫相关的miRNA。然后研究天然免疫相关miRNA的功能。拥有专利情况无拥有其它知识产权情况无项目类别应用基础预期成
4、果与知识产权论文著作(研究报告) 2 篇。预期技术标准制定无是否节能减排不涉及 是否涉及安全生产否 产学研联合否 经费预算总投入 100.00 万元，其中申请市科技局拨款 50.00 万元一、立项的必要性及国内外研究现状、发展趋势和知识产权状况分析（不超过4500字，各栏中不得出现本项目的研究单位名称和项目组成员姓名）天然免疫：机体抵抗病原微生物入侵的第一道屏障。天然免疫（innate immunity）是多细胞生物防御病原体入侵的第一道防线，在生物进化早期发育而成。在对抗微生物的入侵方面，天然免疫的策略是通过模式识别受体（PRR）识别微生物的病原相关分子模式（PAMPs），然后将其清除。To
5、ll样受体（Toll-like receptor, TLR）是一类能识别微生物，特别是细菌和病毒的模式识别受体，可对PAMPs（包括细菌脂多糖、脂蛋白、肽聚糖、鞭毛蛋白、非甲基化CpG DNA、病毒双链RNA、真菌细胞壁等）进行识别、结合。TLRs识别PAMPs后，可以通过与胞浆区内不同的受体接头蛋白结合进行信号转导。髓系分化蛋白88（MyD88）依赖性途径通过形成TLR-MyD88-IRAK受体复合物后，主要以NF-kB途径和MAPK途径使信号下传，激活核转录因子NF-kB和激活蛋白-1(AP-1)，控制炎症因子的分泌。MyD88非依赖性途径主要是通过TRIF(TIR的接头因子)进行信号传递
6、，激活干扰素调节因子3(IRF3)和NF-kB，诱导IFN-b等基因的表达。最终殊途同归，导致炎性介质的释放，启动天然免疫防御。研究显示：TLR4能识别肺炎链球菌溶血素，来介导宿主的前炎症反应，抵抗肺炎链球菌入侵； TLR2、6能够识别肺炎链球菌的细胞壁成分肽聚糖，与正常小鼠相比，TLR2缺陷小鼠清除细菌延迟，导致败血症而更易死于肺炎链球菌感染。结果表明PRR介导的宿主防御机制在细菌（肺炎链球菌）的入侵、定植和清除过程中扮演重要的角色。每种生物都有其自身的病原体，所以不同生物都要调节自身免疫反应，防御特定微生物入侵。为有效清除“非我”并避免损伤“自我”，该过程必需被严谨调节。许多蛋白质因子参与
7、此调节。然而，miRNA可能更适合这一精细调节过程。有初步证据表明miRNA参与调控免疫细胞发育和天然免疫应答。微小RNA：天然免疫的新型调节子。微小RNA（microRNA，miRNA）是指长度约2l25 nt的内源性微小非编码RNA。目前已经通过实验在小鼠（GRCm38）中发现1908个成熟miRNA，人类（GRCh37.p5）中发现2578个成熟miRNA (Sanger miRbase Release 20: June 2013, www.mirbase.org），其中一些在无脊椎动物和脊椎动物之间具有高度同源性。对miRNA的研究表明：miRNA参与了生长发育、器官形成、造血、细胞增
8、殖凋亡、肿瘤形成和天然免疫等重要过程。miRNA具有高度保守性，可分为两类：第一类miRNA多见于动物，与靶基因不完全互补结合，翻译抑制。第二种多见于植物，与靶基因完全互补结合，进行mRNA的切割、降解。此外，还有新发现的miRNA介导靶基因DNA的甲基化。在某些情况下，miRNA可以增加mRNA的翻译甚至可以直接促进mRNA的转录。普遍认为miRNA自身表达的调控主要在转录水平，但也可能于转录后水平被调节。有研究表明在免疫细胞发育过程中特定miRNA表达呈动态调控，比如：miR-17-5p, miR-20a, miR-106a（图1）, miR155, miR-223。图1. miRNA在中
9、性粒细胞和单核细胞免疫反应中的作用 miRNA调节TLR信号通路，参与天然免疫反应。TLR在识别入侵细菌、启动天然免疫反应中发挥重要作用。Taganov等研究发现单核细胞响应细菌脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激，miR-146a, miR-132和miR-155显著上调。有趣的是，miR-146a诱导表达仅能被位于细胞表面并识别细菌组分的TLR引发，但不被细胞内主要感知病毒核酸的TLR引发，表明miR-146a很可能响应细菌入侵而不是病毒感染（图2）。发现miR-146等参与了天然免疫，这是miRNA在天然免疫反应中作用的首次提出。 在单核或者巨噬细胞中，miR-1
10、55在从肠炎沙门氏菌提取的LPS（通过TLR-4）和脂蛋白刺激下（通过TLR-2）表达增加（图1、2）。与miR146不同的是，miR-155表达增加也见于病毒或者细菌源性的核苷酸poly(I:C) (通过TLR-3)和CpG（通过TLR-9）激活的天然免疫反应中（图2）。此外，miR-155会在人单核细胞来源的树突状细胞暴露于LPS中的成熟过程中表达上调，并直接靶向PU.1 mRNA 。幽门螺杆菌感染会诱导miR-155增加，并靶向MyD88。TLR对上皮细胞抗微生物免疫反应很重要。Chen等研究表明人胆管上皮细胞表达与TLR4 mRNA互补的let-7家族成员，并通过转录后抑制调节TLR4
11、表达。 miRNA参与天然免疫的效应：调节炎症细胞因子。感染炎症应答包括数百基因的诱导，该过程必须严谨调节，以获得病原体清除并同时避免基因表达失调的后果（如不受控制的炎症或癌症）。Moschos等利用LPS模拟小鼠肺感染，通过实时PCR检测104个miRNA差异表达，结果表明激发后miRNA平均增加4.3倍。重要的是，这种现象与TNF-、角质化细胞衍生趋化因子（KC）和巨噬细胞炎症蛋白2(MIP2)下降相关，表明miRNA在调节炎症细胞因子产量中的潜在作用。 图2. miRNA在巨噬细胞免疫反应中的作用缺乏miR-223的粒性白细胞成熟过度，对激活刺激高度敏感，并表现为杀真菌活性增强。由于中性
12、粒细胞机能亢进，miR-223突变鼠自发产生炎症性肺病，内毒素攻击后产生严重组织破坏。这些数据表明在小鼠肺感染模型中miR-223是炎症应答的精细调节器。最近，Chen等报道，通过诱导miRNA-223下调来靶向STAT3，能促进TLR触发的IL-6和IL-1在巨噬细胞中产生。在人肺泡上皮细胞中IL-1刺激引起miRNA-146a以时间和浓度依赖方式迅速增长。深入研究发现，miRNA-146a的表达增加负调节促炎症趋化因子IL-8和RANTES释放， miRNA-146a介导调节作用是在翻译水平。该研究表明，miRNA-146a表达快速升高是天然免疫反应过程中，负性调节重度炎症的新机制。有新研
13、究发现TLR9触发的miR-146a上调，靶向树突状细胞中的Notch1，导致IL-12p70的合成减少，引起细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。此外，IRAK2也被确认为miR-146的靶标；miR-4661能在TLR激活的巨噬细胞中从mRNA和蛋白水平上调IL-10的表达。 Ma等发现，小鼠感染李斯特氏菌或牛分枝杆菌后miR-29下调，直接靶向IFN-，从而抑制免疫反应。今年三月的一篇最新报道中，Lawless N等使用下一代测序(next generation sequencing, NGS)，又名深度测序技术，筛选了原代牛乳腺上皮细胞感染乳房链球菌(Streptococcus uberi
14、s, 革兰阳性菌)后不同时间点差异表达的miRNA。发现21个miRNA在感染后有明显差异表达，其中数个miRNA在其它物种中参与免疫系统功能调节。值得提出的是，过去文献报道过的LPS(革兰阴性菌毒力因子之一)能诱导变化的145个miRNA中，仅9个在此研究中有差异表达，表明革兰阳性菌有自己特殊的免疫应答调节。此研究的不足之外在于限于体外，没有从宿主感染模型着手。目前，miRNA参与天然免疫反应这一复杂调控机制的研究尚不够全面。在天然免疫反应中调节作用已经阐明的miRNA，目前仅有为数不多的上述几个，它们相对众多的已知miRNA（小鼠1281 个，人类2042个）远远不够。宿主miRNA参与调节革兰阳性菌(肺炎链球菌)诱导天然免疫反应相关的研究未见报道。为弥补此领域的空白，本课题将通过肺炎链球菌感染小鼠，建立细菌诱导宿主天然免疫反应的模型，利用miRNA芯片从小鼠外周血单核细胞、脾、肺等组织中筛选出不同时相天然免疫相关的miRNA，对获得的miRNA进行系统的功能研究，以阐明其免疫调节机制。申请人具有丰富的miRNA研究经验，已发表多篇miRNA相关SCI论文
