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1、工业微生物,第四章 微生物的生长,第一节 微生物生长的测定,微生物生长情况可以通过测定单位时间里微生物数量或生物量的变化来评价。通过微生物生长的测定可以客观地评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响，或评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制（或杀死）作用的效果，或客观反应微生物的生长规律。因此微生物生长的测量在理论上和实践上有着重要的意义。 根据考察的角度、测定的条件和要求不同，可将微生物生长的测量方法分为直接计数法和间接计数法。,第一节 微生物生长的测定,一、直接计数法 （一） 计数器直接计数法 又称全菌计数法，将待测样品适当稀释后，染色，加到血球计数板 ( 适用于细胞个体形态较大的单细胞微生
2、物，如酵母菌等 ) 或细菌计数板 ( 适用于细胞个体形态较小的细菌 ) 上的计数室内，在显微镜下计数一定体积中的平均细胞数，换算出待测样品的细胞数。 这是一种常用的方法，快速、简便，所得结果是死菌和活菌的总数（图 4-1）。,第一节 微生物生长的测定,图 4-1 血球计数板方格示意图,第一节 微生物生长的测定,（二） 比浊法 这是测定菌悬液中细胞数量的快速方法。其原理是菌悬液中的单细胞微生物的细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。细胞越多，浊度越大，透光量越少。因此，测定菌悬液的光密度 ( 或透光度 ) 或浊度可以反映细胞的浓度。将未知细胞数的悬液与已知细胞数的菌悬液相比，求出未知菌悬液所含
3、的细胞数。浊度计、分光光度计是测定菌悬液细胞浓度的常用仪器。此法比较简便，但使用有局限性。适用于菌悬液浓度在10-7个/mL以上、颜色浅，没有混杂其他物质的样品。,第一节 微生物生长的测定,（三）称重法 这是一种常用的方法，直接称量样品的干重或湿重。一般细菌干重约为湿重的 2025。此法直接而又可靠，但要求测定时菌体浓度较高，样品中不含杂质，对单细胞及多细胞均适用，尤其是测定菌丝体常用的方法。,第一节 微生物生长的测定,（四）菌丝长度测定法 这是针对丝状真菌生长而确定的测定方法，一般在固定培养基上进行。最直接的方法就是将真菌接种到平皿的中央，定时测定菌落的直径或面积。对生长快的真菌，每间隔24
4、h测一次，对生长慢的真菌可以数天测定一次，直到菌落覆盖了整个平皿，据此可以测出菌丝的生长速度。不过这种方法不能反映菌丝的纵向生长，即菌落的厚度和深入培养基的菌丝。另外，接种量也会影响测定结果。,第一节 微生物生长的测定,（五）平板菌落计数 平板菌落计数法可以反映出样品中活菌的数量，又叫活菌计数法。将单细胞微生物待测液经10倍系列稀释后，把最后三个稀释浓度的稀释液各取一定的量接种到琼脂平板培养基上培养，长出的菌落数就是稀释液中含有的活细胞数，据此计算出供测样品中的活细胞数。也可以将经过灭菌后冷却至4550的固体培养基与一定稀释度和体积的菌悬液在培养皿中混匀再倒入培养皿，凝固后培养适当时间，测定菌
5、落形成单位的数目，以此推算出待测样品中的活细胞数。此法要求菌体成分散状态，否则无法确定单个菌落是否由单个细胞形成。因此比较适合于细菌和酵母菌等单细胞微生物计数，不适合于霉菌等多细胞微生物计数。,第一节 微生物生长的测定,（六） 薄膜过滤计数法 测定水与空气中的活菌数量时，由于含菌浓度低，则可先将待测样品 ( 一定体积的水或空气 ) 通过微孔薄膜 ( 如硝化纤维薄膜 ) 过滤浓缩，然后把滤膜放在适当的固体培养基上培养，长出菌落后即可计数。此法适用于测定量大、含菌浓度很低的流体样品，如水、空气等。,第一节 微生物生长的测定,二、间接计数法 （一）测定细胞组分的含量进行估算 1. 含氮量测定法 细胞
6、的蛋白质含量是比较稳定的，可以从蛋白质含量的测定求出细胞物质量。一般细菌的含氮量约为原生质干重14。而总氮量与细胞蛋白质总含量的关系可用下式计算： 蛋白质总量 = 含氮量百分比 6.25,2. DNA 测定法 这种方法是基于 DNA 与 DABA 2HCl( 即新配制的 20 WW ， 3,5 -二氨基苯甲酸盐酸溶液 ) 结合能显示特殊荧光反应的原理，定量测定培养物的菌悬液的荧光反应强度，求得 DNA 的含量，可以直接反映所含细胞物质的量。同时还可根据 DNA 含量计算出细菌的数量。每个细菌平均含 8.4 10 -14 g DNA 。,第一节 微生物生长的测定,3. ATP的含量测定法 ATP
7、是细胞中储存能量的化学形式，它在各种微生物细胞中含量也较为稳定，一般是在10-6mol/L数量级。细菌细胞的ATP含量为每克细胞干重含有1mg ATP。ATP只存在于活细胞中，因细胞死亡后ATP会分解，因此ATP可以快速、灵敏地反映出活菌数量。,第一节 微生物生长的测定,(二)从培养基成分的消耗量来估算 选择一种不用于合成代谢产物的培养基成分为检测对象，如磷酸盐、硫酸盐和镁离子，从这些成分的消耗量可以间接的估算出菌体的生长速度。若发酵的主要产品是菌体本身，也可以从碳源或氧的消耗来估算。 (三）从细胞的代谢产物来估算 在有氧发酵中，CO2是细胞代谢的产物，它与微生物生长密切相关。在全自动发酵罐中
8、大多采用红外线气体分析仪来测定发酵产生的CO2量，进而估算出微生物的生长量。,第一节 微生物生长的测定,（四）从发酵液的粘度来估算 随着菌体量的增加以及粘性的发酵产物的形成，发酵罐的粘度会显著地增大。发酵工厂常采用简单的粘度测定作为发酵生产量的监测指标之一。当然，发酵菌体的裂解或者染菌等不正常情况也会造成发酵粘度的增大或降低，从而产生估算的误差。 （五）从发酵罐的酸碱度来估算 在某些特定的情况下，培养基的pH的变化能较好地反映底物的消耗量和微生物的生长。例如氨的利用结果是释放出H+，导致pH下降；类似地，硝酸盐作为氮源，氢离子被从培养基中移去，导致pH上升。,第一节 微生物生长的测定,一、微生
9、物个体细胞的生长 工业上常接触到的细菌、酵母、霉菌的生长模式如图4-2图4-4所示。,第二节 微生物的生长规律,第二节 微生物的生长规律,（一）细菌细胞的生长 由图4-2中可看出， 就大多数原核生物而言，其单个细胞持续生长直至分裂成两个新的细胞，这个过程称为二等分裂。杆状细菌如大肠杆菌在培养过程中，能观察到细胞延长至大约为细胞最小长度的2倍时，处于细胞中间部位的细胞膜和细胞壁从两个相反的方向向内延伸，逐渐形成一个隔膜，直至2个子细胞被分割开，最终分裂形成2个子细胞。细菌完成一个完整生长周期所需的时间随种的不同而变化很大。这种变化除了主要由遗传特性决定外，还受诸多因子的影响，包括营养和环境条件等
10、。在适宜的营养条件下，大肠杆菌完成一个周期仅需大约 20min，一些细菌甚至比这更快，但更多的比其要慢。,第二节 微生物的生长规律,（二）真菌的生长 酵母菌主要是通过出芽方式繁殖，少数酵母也可以通过分裂或菌丝伸长来繁殖。观察图4-3，芽殖是子细胞在与母细胞大致相同时就从母细胞上分离。酵母的母细胞与子细胞实际上可以识别，因为母细胞产生每个子细胞都会留下一个芽痕，因此酵母细胞的群体有一个连续变化的菌龄分布。,第二节 微生物的生长规律,（三）霉菌的生长 由图4-4可以看出，霉菌的生长特性是菌丝伸长与分支，从菌丝体的顶端通过细胞间的隔膜进行生长。菌丝体既可是长的和分散的，也可以是短的和高度分支的，或者
11、是两者的混合形式。当霉菌生长在培养基表面时，菌丝体可以形成菌落；在深层培养时，菌丝体多数情况下形成菌丝团，也有分散的菌丝形式存在。,第二节 微生物的生长规律,二、微生物群体的生长规律 对微生物群体生长的研究表明，微生物的群体生长规律因其种类不同而异，单细胞微生物与多细胞微生物的群体生长表现出不同的生长动力学特性。但就单细胞微生物而言，在特定的环境中，不同种的微生物表现出趋势相近的生长动力学规律。,第二节 微生物的生长规律,（一）细菌的生长曲线 如将少量细菌纯培养物接种入新鲜的液体培养基中，在适宜的条件下培养，定期取样测定单位体积培养基中的菌体（细胞）数，可发现开始时群体生长缓慢，后逐渐加快，进
12、入一个生长速率相对稳定的高速生长阶段，随着培养时间的延长，生长达到一定阶段后，生长速率又表现为逐渐降低的趋势，随后出现一个细胞数目相对稳定的阶段，最后转入细胞衰老死亡期。如用坐标法作图，以培养时间为横坐标，以计数获得的细胞数的对数为纵坐标，可得到一条定量描述液体培养基中微生物生长规律的实验曲线，该曲线则称为生长曲线（图4-5 ）。,第二节 微生物的生长规律,第二节 微生物的生长规律,图 4 -5 细菌生长曲线,从图4-5可见，生长曲线表现了细菌细胞及其群体在新的适宜的理化环境中，生长繁殖直至衰老死亡的动力学变化过程，细菌生长曲线可划分为四个时期，即：延滞期、指数生长期、稳定期、衰亡期。深入研究
13、各种单细胞微生物生长曲线各个时期的特点与内在机制，在微生物学理论与应用实践上都有着十分重要的意义。,第二节 微生物的生长规律,1延滞期 又称迟缓期、适应期。细菌接种到新鲜培养基而处于一个新的生长环境，因此在一段时间里并不马上分裂，细菌的数量维持恒定，或增加很少。此时细胞内的RNA、蛋白质等物质含量有所增加，细胞体最大，说明细菌并不是处于完全静止的状态。延滞期具有以下特点：a.生长速率常数等于零；b.细胞形态变大或增长，许多杆菌可长成长丝状；c.细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性；d.合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP合成加快，易产生诱导酶；e.对外界不良条件例如NaCl溶液浓度
14、、温度和抗生素等化学药物的反应敏感；f.分裂迟缓、代谢活跃。,第二节 微生物的生长规律,延滞期所维持时间的长短，因微生物种或菌株和培养条件的不同而异，实践表明延滞期可从几分钟到几小时、几天，甚至几个月不等；如大肠杆菌的延滞期就比分枝杆菌短得多。同一菌种或菌株，接种用的纯培养物所处的生长发育时期不同，延滞期的长短也不一样。如接种用的菌种都处于生理活跃时期，接种量适当加大，营养和环境条件适宜，延滞期将显著缩短，甚至直接进入指数生长期。,第二节 微生物的生长规律,2.指数生长期 又称对数生长期。细菌经过延滞期进入指数生长期，并以最大的速率生长和分裂，导致细菌数量呈指数增加，而且细菌内各成分按比例有规
15、律地增加，此时期内的细菌生长是平衡生长。指数生长期的特点：a.生长速率常数最大，细胞每分裂一次所需的代时( G )或原生质增加一倍所需的倍增时间较短；b.菌体的大小、形态、生理特征比较一致；c.酶系活跃，代谢旺盛；d.活菌数和总菌数接近。,第二节 微生物的生长规律,指数生长期中，细胞每分裂一次所需要的时间称为代时( G )，在一定时间内菌体细胞分裂次数愈多，代时愈短，则分裂速度愈快。指数生长期的生长速率受到环境条件（培养基的组成成分、培养温度、 pH与渗透压等）的影响，也是特定条件下微生物菌株遗传特性的反映。总的来说，原核微生物细胞的生长速率要快于真核微生物细胞，形态较小的真核微生物要快于形态
16、较大的真核微生物。不同种类的细菌，在同一生长条件下，代时不同；同一种细菌，在不同生长条件，代时也有差异。但是，在一定条件下，各种细菌的代时是相对稳定的，有的 2030 min，有的几小时甚至几十小时（表4-1）。,第二节 微生物的生长规律,第二节 微生物的生长规律,表 4-1 某些微生物的生长代时,处于指数生长期的细胞，由于代谢旺盛，生长迅速，代时稳定，个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，因此，在微生物发酵生产中，常用指数期的菌体作种子，它可以缩短延滞期，从而缩短发酵周期，提高劳动生产率与经济效益。指数生长期的细胞也是研究微生物生长代谢与遗传调控等生物学基本特性的极好材料。,第二节 微生物的生长规律,3 .稳定生长期 细胞的指数期生长不会是无限期的，一方面培养基中必要营养成分的耗尽或其浓度不能满足维持指数生长的需要而成为生长限制因子；另一方面细胞的排出物在培养基中的大量积累，以致抑制菌体生长。由上述两方面主要因素所造成的细胞内外理化环境的改变，营养物质消耗，代谢产物积累、氧化还原电位的变化和pH等一些因子的综合作用，导致细胞生长速率降
