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1、实验三 茚三酮显色法测定氨基酸含量,一、实验原理,茚三酮溶液与氨基酸共热,生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应,生成紫色化合物。颜色的深浅与氨基酸的含量成正比,可通过测定570nm处的光密度,测定氨基酸的含量,二、试剂与材料,(1)标准氨基酸溶液:配制成0.3mM溶液(本实验用赖氨酸)(已配) (2)pH5.4,2M醋酸缓冲液:量取2M 86ml醋酸钠溶液,加入14ml 2M乙酸混合而成。用pH计较正(250ml/班) (3)茚三酮显色液:称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮,用10ml乙二醇甲醚溶解(15ml/组),还原型茚三酮按下法制备:称取0.5g茚三酮,用12.5ml沸蒸馏水溶解,得
2、黄色溶液。将0.5g维生素C用25ml温蒸馏水溶解,一边搅拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中,不断出现沉淀滴定后继续搅拌15min,然后在冰箱内冷却到4,过滤、沉淀用冷水洗涤3次,真空干燥,置五氧化二磷真空干燥器中保存备用,(4)60%乙醇(50ml/组 ) (5)样品液:每ml含0.5-50ug氨基酸(已配) (6)分光光度计 (7)水浴锅,1、标准曲线的制作 分别取0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1.0ml0.3mM的标准氨基酸溶液于试管中,用水补足到1ml。各加入1ml2M醋酸缓冲液;再加入1ml茚三酮显色液,充分混合后盖住试管口,在100水浴中加热15min,用自来水冷
3、却。放置5min后,加入3ml60%乙醇稀释,充分摇匀,用分光光度计测定OD570(脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色,应测定OD440)。以OD570为纵坐标,氨基酸含量为横坐标,绘制标准曲线。,三、操作方法,2、氨酸酸样品的测定: 取样品液1ml,加入pH5.4,2M醋酸缓冲液和茚三酮显色液各1ml混匀后于100沸水中加热15min,自来水冷却。放置5min后,加3ml60%乙醇稀释,摇匀后测定OD570(生成的颜色在60min内稳定) 将样品测定的OD570与标准曲线对照,可确定样品中氨基酸的含量 样品同时做三份取平均数,四、结果与计算,氨基酸的含量(g/100ml)=X*100 X为查标准曲线所获得每ml含量g数 自配样品 X*250/称取克数(X为查标准曲线所获得每ml含量g数) 250为稀释的倍数,五、讨论与分析 六、思考题 茚三酮是否可用于氨基酸和蛋白质的定性鉴定?,