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1、CO-IP实验详解一、 实验材料详见Western Blot实验详解二、 实验原理免疫共沉淀（CO-IP）是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；（
2、2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。三、操作程序（一）蛋白样制备1. 无双抗DMEM（10%血清）接皿，代细胞长至80%时，细胞转染，6h后换含双抗DMEM（10%血清），再过18h后，换液，加入含MG132 (25mM)，双抗的DMEM（10%血清）处理细胞，培养4h。2. 吸出培养液，用PBS洗1-2次。每个皿（100mm）加入1ml CO-IP细胞裂解液（含20ul cocktail蛋白酶抑制剂），摇均匀，刮细胞。将收集液于4度摇转仪摇动
3、20min。4度12000rpm 10min，取上清蛋白定量（试剂盒）。取500ug蛋白，用CO-IP细胞裂解液将体积补到500ul。（注意：剩余的含蛋白的细胞裂解液可用于Western Blot）3. 用Agarose A+G预处理样品，每管加入30ul Agarose A+G，以及同种属的其他抗体0.5ug（消除非特异性），于4度摇转仪反应2h。4. 将预处理后的样品4度3000rpm 5min，取上清。5. 加抗体发生反应，与目标蛋白反应过夜（12h）。（Flag按说明书1：200加入约为2.5ul/管。6. 抗体偶联12h后，加入Agarose A+G （30ul/管），4度摇转仪反应
4、3-6h。7. 反应6h后，3000rpm 5min，弃上清，留沉淀于1.5ml EP管中。8. 用预冷的裂解液洗涤上述沉淀：加入1ml裂解缓冲液，于4度摇转仪反应10min。（再重复7、8两次，共3次）9. 收集沉淀，加入30ul 2Sample Buffer，沸水5min，立即置于冰上，待冷却至室温后，12000rpm 10min，取30ul上样。（注意：该蛋白样品用于CO-IP）（二）SDS-PAGE/Western Bolt 方法详见Western Blot实验详解四、注意事项（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的 cocktailer。（2）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；（3）要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；（4）确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。
