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1、人类免疫缺陷病毒1型p24抗原酶联免疫试剂盒说明书【产品名称】通用名：人类免疫缺陷病毒1型p24抗原酶联免疫试剂盒英文名：ENZYME IMMUNOASSAY FOR DETECTION OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS TYPE I P24 ANTIGEN IN HUMAN SERUM, PLASMA AND CELL CULTURE SUPERNATANT【包装规格】96人份/盒。【预期用途】本试剂盒用于人类免疫缺陷病毒1型p24抗原（Human Immunodeficiency Virus Type 1 p24 Antigen）的定量检测，适用于人血清（或血
2、浆）及细胞培养上清液等标本，仅供研究使用。【检验原理】本产品采用固相酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测人血清（或血浆）中的游离HIV-1 p24抗原和细胞培养上清液等标本中的HIV-1 p24抗原。本分析方法是基于双抗体夹心的非竞争性免疫分析。校准品和样品中HIV-1 p24抗原与固相抗- p24单克隆抗体和生物素标记的抗-p24多克隆抗体通过免疫反应，形成固相抗-p24单克隆抗体p24抗原抗-p24多克隆抗体-生物素复合物；温育后洗涤，洗去非特异或多余的抗原和多余的生物素标记的抗- p24多克隆抗体；然后加入HRP（Hor
3、seradish Peroxidase，辣根过氧化物酶）标记的链亲和素，形成固相抗- p24单克隆抗体p24抗原抗-p24多克隆抗体-生物素链亲和素-HRP复合物；温育后洗涤，洗去多余的HRP标记的链亲和素。加入TMB-H2O2底物溶液，HRP催化H2O2氧化TMB生成蓝色的产物（最大吸收峰655nm），加入终止液终止酶催化反应，生成黄色产物（最大吸收峰450nm）。其吸光度与校准品和样品中的HIV-1 p24抗原浓度成正相关。通过剂量反应曲线可得出样品中HIV-1 p24抗原浓度。试验类型温育时间试验所需时间试验温度试验所需样本体积免疫度量分析120 分钟大约150分钟37C 和室温（183
4、0）75L反应原理图：MicrowellBiotinylated rabbit anti-HIV-1 p24 antibodiesMouse anti-HIV-1 p24 antibodiesSample HIV-1 p24 AntigenHRP Conjugated StreptavidinAbsorbanceSignal Reagent【主要组成成份】1. 抗体包被板（Antibody Coated Microplate）1块包被有鼠抗-HIV-1 p24单克隆抗体的聚苯乙烯微孔板，约200ng/孔。8孔12条。铝箔袋密封包装，含干燥剂。标签编号为R1。2. HIV-1 p24抗原校准品（
5、HIV-1 p24 Antigen Calibrator）1mL1支重组HIV-1 p24抗原溶液，200IU/mL（约相当于4,000pg/mL），稀释液为校准品稀释液。用英国国家生物标准与检定所(National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC)提供的WHO标准品（HIV-1 p24 Antigen 90/636）校准。绿色PP盖子和无色PP塑料管。标签编号为R2。3. 校准品稀释液（Calibrator Diluent）20mL1瓶磷酸盐缓冲液，含动物血清和钙化的正常人血浆（经ELISA检测，HBsAg、抗-HC
6、V和抗-HIV 1+2均为阴性），pH约7.3。防腐剂为NaN3（不超过0.1%）和EDTA。绿色PP盖子和无色HPDE塑料瓶。标签编号为R3。4. 生物素标记抗体（Biotinylated Antibody）5mL1瓶生物素标记的兔抗-HIV-1 p24多克隆抗体，约4g/mL。缓冲液为Tris-HCl，含动物血清、稳定剂、表面活性剂和绿色染料，pH约7.4。防腐剂为NaN3（不超过0.1%）。蓝色PP盖子和无色HPDE塑料瓶。标签编号为R4。5. HRP标记链亲和素（HRP Conjugated Streptavidin）20mL1瓶HRP标记链亲和素，约0.1g/mL（25mU/mL H
7、RP）。缓冲液为Tris-HCl，含动物血清、稳定剂、表面活性剂和红色染料，pH约7.4。防腐剂为ProClin300（不超过1%）。红色PP盖子和棕色HPDE塑料瓶。标签编号为R5。6. 浓缩洗涤液（Concentrated Wash Buffer）50mL1瓶含表面活性剂的磷酸盐缓冲液，20倍浓缩。防腐剂为ProClin300（不超过1%）。无色PP盖子和无色HPDE塑料瓶。标签编号为R6。7. 底物缓冲液（Substrate Buffer）10mL1瓶含H2O2的乙酸盐缓冲液，pH约5.0。无色PP盖子和无色HPDE塑料瓶。标签编号为R7。8. 显色剂（Chromogen Solutio
8、n）10mL1瓶含TMB的乙酸溶液，pH约3.0。白色PP盖子和棕色HPDE塑料瓶。标签编号为R8。9. 终止液（Stop Solution）10mL1瓶2mol/L H2SO4溶液。黄色PP盖子和无色HPDE塑料瓶。标签编号为R9。10. 封板膜（Plate Sealer）6张用于温育时微孔板的密封。11. 说明书（Instruction for Use）1份本产品使用说明。【储存条件及有效期】试剂盒置28保存，有效期为12个月。【适用仪器】酶标仪、洗板机、恒温培养箱等。【样本要求】1. 样本：人血清（或血浆）样本，和细胞培养上清液等标本。2. 存放：样本于28可储存2天；样本长期储存应放置
9、于-20或-20以下环境中，且不宜反复冻融5次以上。【检验方法】1. 试剂配制方法A、 HIV-1 p24校准品系列的配制：取6支离心管，编号A、B、C、D、E和F。管F中取900L校准品稀释液，加入100L HIV-1 p24校准品（200IU/mL，4,000pg/mL），混匀，作1:10稀释，配制成校准品F（20IU/mL，400pg/mL）；管E中取500L校准品稀释液，加入500L校准品F，混匀，作1:2稀释，配制成校准品E（10IU/mL，200pg/mL） ；管D中取500L校准品稀释液，加入500L校准品E，混匀，作1:2稀释，配制成校准品D（5IU/mL，100pg/mL）；
10、管C中取500L校准品稀释液，加入500L校准品D，混匀，作1:2稀释，配制成校准品C（2.5IU/mL，50pg/mL）；管B中取500L校准品稀释液，加入500L校准品C，混匀，作1:2稀释，配制成校准品B（1.25IU/mL，25pg/mL）；以校准品稀释液作为校准品A。共配制成6个浓度的HIV-1 p24校准品系列（A-F）：A 0、B 1.25IU/mL（25pg/mL）、C 2.5IU/mL（50pg/mL）、D 5IU/mL（100pg/mL）、E 10IU/mL（200pg/mL）和 F 20IU/mL（400pg/mL）。配制好的HIV-1 p24校准品系列应保存在28C，于
11、一月内使用。校准品浓度离心管编号校准品稀释液加入20IU/mL（400pg/mL）F900L100L R210IU/mL（200pg/mL）E500L500L 管 F5IU/mL（100pg/mL）D500L500L 管E2.5IU/mL（50pg/mL）C500L500L 管D1.25IU/mL（25pg/mL）B500L500L 管CB、 工作浓度洗涤液的配制：用纯水（蒸馏水或去离子水）将浓缩洗涤液稀释20倍，即为工作浓度洗涤液。工作浓度洗涤液应保存在28，于一月内使用。2. 标准操作方法A、 从铝箔袋中取出所需数量的微孔板条，装至微孔板架上。设空白对照1孔，HIV-1 p24校准品A、B
12、、C、D、E和F各2孔，其余各孔为待测样品，建议每个待测样品均设置2孔；编号标记。向各孔内分别加入25L的生物素标记抗体（空白对照孔不加），然后再向各孔内分别加入75L的HIV-1 p24校准品或待测样品，轻轻振荡微孔板，使内容物充分混匀。B、 用封板膜将微孔板密封，置37温育60分钟。C、 弃去微孔板反应孔内液体，每孔（含空白对照孔）加入350L工作浓度洗涤液，然后将洗涤液弃去。重复洗板共5次，最后拍干。D、 每孔加 HRP标记链亲和素100L（空白对照孔不加），用封板膜将微孔板密封，置37温育30分钟。E、 弃去微孔板反应孔内液体，每孔（含空白对照孔）加入350L工作浓度洗涤液，然后将洗涤
13、液弃去。重复洗板共5次，最后拍干。F、 每孔加底物缓冲液和显色剂各50L（含空白对照孔），用封板膜将微孔板密封，置室温（1830）避光温育30分钟。G、 每孔加终止液50L（含空白对照孔），轻轻振荡微孔板，使内容物充分混匀。H、 终止反应后1小时内，用酶标仪在450nm波长处，测定各孔吸光度值，参考波长选择620-700nm。3. 数据处理A、 求出HIV-1 p24抗原校准品的吸光度平均值。B、 以HIV-1 p24抗原校准品的吸光度平均值为纵轴，以HIV-1 p24校准品的浓度为横轴，在双对数坐标图上作出标准曲线。C、 如果待测样品试验了2孔，求出待测样品的吸光度平均值。D、 将测得的样品
14、的吸光度值（或吸光度平均值）在上述标准曲线上求出样品中的HIV-1 p24抗原的浓度。也可以通过软件用最小二乘法拟合曲线，求出样品中的HIV-1 p24抗原的浓度。【检验结果的解释】 1. 质量控制：空白对照校准品吸光度值不高于0.050，A点（0pg/mL）吸光度值不高于0.100，F点（400pg/mL）吸光度值不低于1.000。2. 对于吸光度值超出校准品F点的样品，可用校准品稀释液稀释适宜倍数后再行测定，样本中HIV-1 p24抗原浓度值为稀释后测定值稀释倍数。【检验方法的局限性】1. 本品仅适用于研究用途，不用于临床诊断。2. 本品仅适用于游离的HIV-1 p24抗原含量的检测，不能
15、用于总抗原含量的检测。3. 样本pH应保证在5-10之间，过低或过高的pH可能会造成HIV-1 p24抗原的测量值异常。【产品性能指标】1. 测定范围：0400pg/mL。2. 分析灵敏度：最低检测限不高于5pg/mL。3. 校准品剂量-反应曲线的线性：线性相关系数R0.9900。典型校准曲线如下图4. 精密性：批内变异系数（Within-Run CV）不高于10%，批间变异系数（Between-Run CV）不高于15%。5. 特异性：与HIV-1和HIV-2的env蛋白、pol蛋白和gag蛋白中的p17（1型）等无交叉反应。6. 胆红素（Bilirubin，20mg/dL）、血红蛋白（Hemoglobin，500mg/dL）和血脂（Triolein， 3,000mg/dL）对HIV-1 p24抗原的测量值无明显干扰。7. 抗凝剂（肝素0.2mg/mL、柠檬酸钠100mg/
