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1、流式细胞仪分别检测小鼠外周血CD4+和CD8+采血【实验】实验鼠16管/天*2，每个样本100ul+30ul肝素钠【空白】【CD4+】【CD8+】正常鼠，第一天实验取300ul+90ul肝素钠步骤1）30ul肝素钠溶液处理100ul全血2）取抗凝血100ul加入到标记好的流式管内，【实验】16管/天，每管加入2ul FITC Rat Anti-Mouse CD4（0.5mg/ml）和5ul PE Rat Anti-Mouse CD8a （0.2mg/ml）除样品管外，第一天需外加三管对照l 【空白】（正常鼠全血100ul）l 【CD4+】（正常鼠全血100ul+2ul FITC Rat Ant
2、i-Mouse CD4（0.5mg/ml）l 【CD8+】（正常鼠全血100ul+5L PE Rat Anti-Mouse CD8a（0.2mg/ml）4）避光放置30min5）加入红细胞裂解液2mL（此处用量至少68ml，两次破红136ml），轻轻吹打混匀，室温避光反应15min，以1500rpm离心5min，弃上清（观察破红效果，建议重复一次）6）加2mL PBS混匀后，1500rpm离心5min，弃上清7）细胞沉淀加入500ul PBS重悬后上机流式细胞仪分别检测小鼠外周血IFN-和IL-4（三色） 采血【实验】实验鼠，16管/天*2，每个样本100ul+30ul肝素钠【空白】【CD4】
3、【IFN-】【IL-4】正常鼠，第一天实验取400ul+120ul肝素钠步骤1. 全血刺激培养100ul 全血+100ul 含刺激物的RPMI 1640完全培养液，于37、5% CO2 中孵育4h，计时器计时，手机计时每小时轻轻颠倒混匀一次2. 裂解红细胞将上述液体转移到流式管内（200ul），加入红细胞裂解液2mL（此处用量至少80ml，两次160ml），轻轻吹打混匀，室温避光15min（观察破红效果，建议重复一次）1500rpm离心5min，留沉淀每管中加入2ml 染色缓冲液混合均匀，1500rpm，5min离心，留沉淀3. 细胞表面抗原的染色（CD4）l 【CD4】【实验】管各加FITC
4、 anti-mouse CD4（0.5mg/ml）2 ul+染色缓冲液 98 ull 【IFN-】【IL-4】【空白】加入100ul染色缓冲液室温避光15min后，每管中加入2ml染色缓冲液混合均匀，1500rpm，5min离心，弃上清，留沉淀4. 固定和透化细胞每管中加入500ul 固定/透化剂（棕瓶），充分混匀，避光20min，1500rpm离心5min，弃上清，留沉淀加2ml 1BD Perm/washTMBuffer，避光10min，1500rpm，离心5min，弃上清，留沉淀5. 胞内细胞因子的染色（IFN-and IL-4）l 【CD4】【空白】100ul Perm/washTMB
5、ufferl 【IFN-】95ul Perm/washTMBuffer + 5uL PE anti-mouse IFN-（0.2mg/ml）l 【IL-4】95ul Perm/washTMBuffer + 5uL PE Rat Anti-Mouse IL-4（0.2mg/ml）l 【实验】5ul PE anti-mouse IFN-（0.2mg/ml）+ 5ul PE Rat Anti-Mouse IL-4（0.2mg/mL）+90ul Perm/washTMBuffer30min避光孵育。加入2ml 1BD Perm/washTMBuffer，室温避光孵育10min，1500rpm，5min。弃上清，加入500ulPBS重悬细胞后上机检测
