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1、流式细胞仪分别检测小鼠外周血CD4+和CD8+采血【实验】实验鼠16管/天*2,每个样本100ul+30ul肝素钠【空白】【CD4+】【CD8+】正常鼠,第一天实验取300ul+90ul肝素钠步骤1)30ul肝素钠溶液处理100ul全血2)取抗凝血100ul加入到标记好的流式管内,【实验】16管/天,每管加入2ul FITC Rat Anti-Mouse CD4(0.5mg/ml)和5ul PE Rat Anti-Mouse CD8a (0.2mg/ml)除样品管外,第一天需外加三管对照l 【空白】(正常鼠全血100ul)l 【CD4+】(正常鼠全血100ul+2ul FITC Rat Ant
2、i-Mouse CD4(0.5mg/ml)l 【CD8+】(正常鼠全血100ul+5L PE Rat Anti-Mouse CD8a(0.2mg/ml)4)避光放置30min5)加入红细胞裂解液2mL(此处用量至少68ml,两次破红136ml),轻轻吹打混匀,室温避光反应15min,以1500rpm离心5min,弃上清(观察破红效果,建议重复一次)6)加2mL PBS混匀后,1500rpm离心5min,弃上清7)细胞沉淀加入500ul PBS重悬后上机流式细胞仪分别检测小鼠外周血IFN-和IL-4(三色) 采血【实验】实验鼠,16管/天*2,每个样本100ul+30ul肝素钠【空白】【CD4】
3、【IFN-】【IL-4】正常鼠,第一天实验取400ul+120ul肝素钠步骤1. 全血刺激培养100ul 全血+100ul 含刺激物的RPMI 1640完全培养液,于37、5% CO2 中孵育4h,计时器计时,手机计时每小时轻轻颠倒混匀一次2. 裂解红细胞将上述液体转移到流式管内(200ul),加入红细胞裂解液2mL(此处用量至少80ml,两次160ml),轻轻吹打混匀,室温避光15min(观察破红效果,建议重复一次)1500rpm离心5min,留沉淀每管中加入2ml 染色缓冲液混合均匀,1500rpm,5min离心,留沉淀3. 细胞表面抗原的染色(CD4)l 【CD4】【实验】管各加FITC
4、 anti-mouse CD4(0.5mg/ml)2 ul+染色缓冲液 98 ull 【IFN-】【IL-4】【空白】加入100ul染色缓冲液室温避光15min后,每管中加入2ml染色缓冲液混合均匀,1500rpm,5min离心,弃上清,留沉淀4. 固定和透化细胞每管中加入500ul 固定/透化剂(棕瓶),充分混匀,避光20min,1500rpm离心5min,弃上清,留沉淀加2ml 1BD Perm/washTMBuffer,避光10min,1500rpm,离心5min,弃上清,留沉淀5. 胞内细胞因子的染色(IFN-and IL-4)l 【CD4】【空白】100ul Perm/washTMB
5、ufferl 【IFN-】95ul Perm/washTMBuffer + 5uL PE anti-mouse IFN-(0.2mg/ml)l 【IL-4】95ul Perm/washTMBuffer + 5uL PE Rat Anti-Mouse IL-4(0.2mg/ml)l 【实验】5ul PE anti-mouse IFN-(0.2mg/ml)+ 5ul PE Rat Anti-Mouse IL-4(0.2mg/mL)+90ul Perm/washTMBuffer30min避光孵育。加入2ml 1BD Perm/washTMBuffer,室温避光孵育10min,1500rpm,5min。弃上清,加入500ulPBS重悬细胞后上机检测