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1、高等职业教育技能型人才培养培训工程系列教材,第四章 色谱分离法,知识目标：,掌握各种色谱分离技术的特点及适 用范围。 理解色谱分离方法的基本原理。 了解色谱分离方法的分类。,能力目标：,能够熟练使用氧化铝色谱法、硅胶色谱法、聚酰胺色谱法、离子交换色谱法、薄层色谱法、纸色谱法的操作技术对天然药物提取液进行分离。 学会活性炭色谱法、凝胶色谱法、大孔吸附树脂法、电泳技术、干柱色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法的操作技术。,本 章 内 容,概 述,基本知识,同步测试,本章小结,色谱技术,如果天然药物的提取物中含有一些结构相似、性质相近的化学成分，用一般分离方法无法获得分离，那么，使用色谱分离法往往能获
2、得较好的分离效果。色谱分离法具有试样用量少，分离效率高的特点，是目前被广泛应用的分离纯化和鉴定化合物的一种有效方法。具体应用时，可根据被分离化合物的性质和各种色谱分离法的特点，选择合适的色谱方法。,概 述,本章学习的色谱分离方法有氧化铝色谱法、硅胶色谱法、活性炭色谱法、聚酰胺色谱法、离子交换色谱法、大孔吸附树脂法、凝胶色谱法、薄层色谱法、纸色谱法、电泳技术、干柱色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法。,概 述,概 念,概 念,色谱分离法（Chromatography）是一种分离、纯化和鉴定化合物的现代理化分离分析方法。,（1）按色谱分离原理的不同可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、电
3、泳技术等。,色谱分离法的分类,色谱法分类,（2）按操作方式的不同分类可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱和毛细管电泳色谱等。,（3）按固定相或支持剂种类的不同分类可分为氧化铝色谱、硅胶色谱、聚酰胺色谱、凝胶色谱等。,（4）按移动相种类的不同分类可分为气相色谱、液相色谱和超临界流体色谱等。,色谱分离法的基本原理,色谱法原理,利用混合物中各成分在固定相和移动相中吸附、分配及其亲和力的不同，当两相作相对运动时，这些成分在两相间进行反复多次的吸附或分配，从而得到分离。,色谱分离法的基本原理,1吸附色谱的原理,利用作为固定相的吸附剂对混合物中各种成分吸附能力的大小不同，使各成分得到相互分离。,常用的吸附剂有：
4、硅胶、氧化铝、聚酰胺和活性炭。,色谱法原理,色谱分离法的基本原理,1吸附色谱的原理,应用吸附色谱时，需全面考虑吸附剂、溶剂及被分离成分三者间相互联系又相互制约的关系，选择合适的条件，使达到分离的目的。,如果被分离物质的极性较大，可选用活度较低的吸附剂和极性较大的移动相；如果被分离物质的极性较小，可选用活度较高的吸附剂和极性较小的移动相。,色谱法原理,色谱分离法的基本原理,1吸附色谱的原理,常见一些化合物官能团的极性大小顺序如下：,色谱法原理,色谱分离法的基本原理,2分配色谱的原理,利用混合物中各成分在互不相溶的两相溶剂中分配系数的不同而获得分离。两相溶剂中的一相需作为固定相，常以某种惰性固体吸
5、住该相溶剂，使之固定，这种吸着了固定相溶剂的固体物质称为支持剂（也称载体或担体）；另一相溶剂则作为移动相。,色谱法原理,色谱分离法的基本原理,3离子交换色谱的原理,利用离子交换树脂上的功能基能在水溶液中与溶液的其他离子进行可逆性交换的性质，以离子交换树脂作为固定相，使混合成分中离子型与非离子型物质、或具有不同解离度的离子化合物得到分离。,色谱法原理,色谱分离法的基本原理,4凝胶色谱的原理,以凝胶作为固定相，选择适当的溶剂作为移动相，随着移动相的流动，由于受凝胶颗粒中网孔半径的限制，被分离试样中比网孔小的化合物可自由进入凝胶颗粒内部，而比网孔大的化合物不能进入凝胶颗粒内部被排阻，只能通过凝胶颗粒
6、外部的间隙，使混合物中分子量大小不同的化合物移动速率不同而得到分离。,色谱法原理,色谱分离方法的应用,色谱法应用,天然药物化学成分种类繁多，各有其特定的性质，可选择不同的色谱方法进行分离。一般而言，对于非极性成分常选用硅胶或氧化铝吸附色谱；对于极性较大的成分则选用分配色谱或弱吸附剂吸附色谱；对于酸性、碱性、两性成分可选用离子交换色谱，有时也可选用吸附色谱或分配色谱；对于分子量大小有差异的成分则可选用凝胶色谱。,色谱分离方法的应用,例如一般生物碱的分离用硅胶或氧化铝柱色谱，极性较大的生物碱则用分配色谱，季铵型水溶性生物碱可用分配色谱或离子交换色谱；皂苷、强心苷的分离可用分配色谱或硅胶吸附色谱；挥
7、发油、甾体、萜类常首先选用硅胶及氧化铝色谱；黄酮类、鞣质等成分可用聚酰胺吸附色谱；有机酸、氨基酸可用离子交换色谱，有时也用分配色谱，或某些氨基酸类采用活性炭吸附色谱；而蛋白质、多肽、多糖等大分子化合物则常用凝胶色谱。,色谱法应用,色谱分离方法的应用,随着色谱理论的逐步发展，结合电子学、光学、计算机技术的发展和应用，色谱分离技术日趋仪器化、自动化和高速化，可快速分离复杂样品中的众多成分，现已逐渐成为一种重要的分离、分析工具，被广泛用于化工、医药、生化和环境保护等领域。,色谱法应用,色谱分离方法的应用,随着色谱理论的逐步发展，结合电子学、光学、计算机技术的发展和应用，色谱分离技术日趋仪器化、自动化
8、和高速化，可快速分离复杂样品中的众多成分，现已逐渐成为一种重要的分离、分析工具，被广泛用于化工、医药、生化和环境保护等领域。,色谱法应用,色谱分离方法的应用,【相关链接】 “色谱”的由来,20世纪初，俄国的波兰植物化学家茨维特（M.S.Tswett）在研究植物色素的过程中，首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同，分布不同，因此在玻璃管中呈现出不同的颜色，这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。到1907年，茨维特的论文用俄文公开发表，他把这种方法命名为chromatography，即中文的“色谱“，这就是现代“色谱”这一名词的来源。,色谱法应用
9、,色 谱 技 术,氧化铝色谱法,硅胶色谱法,活性炭色谱法,聚酰胺色谱法,离子交换色谱法,大孔吸附树脂法,凝胶色谱法,薄层色谱法,纸色谱法,电泳技术,干柱色谱法,气相色谱法,高效液相色谱法,色谱技术,一、氧化铝色谱法,氧化铝是一种吸附力很强的亲水性吸附剂，有酸性、碱性、中性三种规格。其吸附活性与含水量有关，随着含水量的增加，吸附能力减弱。氧化铝的吸附能力大小，可根据含水量用不同的活度级别来表示（表4-1），通过活化或去活化的操作得到不同活度级别的氧化铝，一般在400左右加热6小时，即可得级的氧化铝。,是利用作为固定相的氧化铝对混合物中各种成分吸附能力的大小不同，使各成分得到相互分离的方法。,色谱
10、技术,一、氧化铝色谱法,表4-1 硅胶、氧化铝活度与含水量关系,色谱技术,一、氧化铝色谱法,常采用柱色谱（column chromatography）的操作方法。柱色谱是一种将分离材料装入柱状容器中，以适当的洗脱剂进行洗脱而使不同成分得到分离的色谱分离方法，也是色谱法最早出现的形式。具体操作如下：,操作步骤,色谱技术,一、氧化铝色谱法,（1）色谱柱的选择：实验室常用的色谱柱的内径与柱长之比，常在110120之间。如图4-1所示的色谱柱装置。如果用于分离两种或两种以上性质相近的混合物，可选用细长的色谱柱；而需要从溶液中吸去某种成分或滤除不溶物及使用活性炭脱色时滤除细微的活性炭颗粒等，则可选用较粗
11、矮的色谱柱。,操作步骤,色谱技术,一、氧化铝色谱法,图4-1 柱色谱装置,色谱技术,一、氧化铝色谱法,（2）装柱：装柱前先将空色谱柱清洗干净，干燥后，在色谱柱管底部铺一层脱脂棉，再加一层厚约0.5cm的石英砂，然后选择具体干法或湿法装柱。常选用湿法装柱，先往柱内加入少量的洗脱剂，然后将氧化铝与适量的洗脱剂混合均匀，不断搅拌排除气泡后，连续缓慢地倒入色谱柱内，打开色谱柱下端活塞，低速放出洗脱剂，使氧化铝慢慢沉降，注意继续补充洗脱液保持流速，确保液面高于氧化铝的表面，,操作步骤,色谱技术,一、氧化铝色谱法,同时轻轻敲打柱壁，至氧化铝沉降完全后，再使洗脱剂流动一段时间，算出柱内所含洗脱剂的体积，以便
12、掌握收集流份的时间及在更换洗脱剂时，新换洗脱剂大致在何流份开始。保持洗脱液液面高出氧化铝表面一段距离，以防柱床干凅。装柱后，一般氧化铝的高度为色谱柱高度的3/4,要求柱中氧化铝充填均匀，柱体内不能出现空气泡、疏密不均或裂缝。,操作步骤,色谱技术,一、氧化铝色谱法,（3）上样：对于易溶于洗脱剂的试样，可用洗脱剂溶解试样制成高浓度试样溶液，放出色谱柱内洗脱液至液面略高于氧化铝表面，然后沿柱壁轻轻注入试样液，注意不要使氧化铝表面受搅动，打开活塞，使试样液缓缓渗入氧化铝柱内。对于难溶于洗脱剂的试样，则先将试样溶于适量甲醇、丙酮等低沸点的极性有机溶剂中，再用少量氧化铝拌匀，,操作步骤,色谱技术,一、氧化
13、铝色谱法,在旋转蒸发器上小心蒸干溶剂或水浴挥干溶剂，置干燥器中吸除残留的溶剂和水分，然后将此吸着试样的氧化铝均匀地加在色谱柱中氧化铝的上面。加样后，要求试样层能够尽量窄且平整。最后，在上样后的氧化铝柱上面盖上一层约0.5cm厚的石英砂（或一层滤纸和玻璃珠层），使洗脱过程中柱体顶端保持平整。,操作步骤,色谱技术,一、氧化铝色谱法,（4）洗脱：洗脱剂的选用一般参照薄层色谱帮助确定的色谱条件，同时注意用梯度洗脱的方法，逐渐提高洗脱能力，使成分得到分离。洗脱的过程中应注意保持液面的高度，勿使柱面洗脱剂流干；控制洗脱剂的流速，一般不宜太快，若色谱柱长40cm，可控制流速为34ml/分钟，且保持匀速。洗脱
14、液的收集根据具体分离情况而定，如果试样中各成分有色，分离过程中在柱上可观察到，则分别收集各色带；如果试样中各成分无色，常采用等份收集。,操作步骤,色谱技术,一、氧化铝色谱法,根据所用氧化铝的量及试样分离的具体情况决定收集的每份洗脱液的体积。如所用氧化铝的量为50g，则每份收集的洗脱液为50ml；若试样各组分的结构相似或洗脱剂极性很大，则每份洗脱液收集量小。 洗脱后所得的各份洗脱液分别进行适当的浓缩，经薄层色谱检测后，合并相同流分，回收溶剂，获得单体。若为混合物，可进一步分离纯化。,操作步骤,色谱技术,一、氧化铝色谱法,（5）氧化铝的再生：柱色谱分离结束后，将柱内氧化铝倾出，用甲醇、稀醋酸、氢氧
15、化钠溶液及水洗涤，再经高温活化后可重复使用。 亦可采用薄层色谱的操作方法，具体操作参照薄层色谱法。,操作步骤,色谱技术,一、氧化铝色谱法,（1）氧化铝适用于碱性或中性的亲脂性成分的分离，如生物碱、甾体化合物、强心苷等，尤其是对生物碱的分离应用最多。具有分离效果好，再生容易，对杂质的吸附能力及分离试样的用量均优于硅胶等优点，但由于与某些酸性、酚性物质及色素等可发生异构化、氧化和消除反应等次级反应，故对醛、酮、酯、内酯等类型化合物的分离不宜采用。,操作提示,色谱技术,一、氧化铝色谱法,（2）柱色谱中氧化铝用前应过筛处理，使粒度均匀，常以100目左右大小为宜。 （3）柱色谱中氧化铝的用量一般为样品量
16、的2050倍，如果氧化铝对样品的吸附力较弱，则适当增加用量至100200倍。,操作提示,色谱技术,一、氧化铝色谱法,【相关链接】,1什么是活化？,在一定温度下加热除去吸附剂中的水分，使吸附剂吸附能力增强，活性增高的过程称为活化。,2什么是去活化？,在吸附剂中加入一定量的水分，使吸附剂吸附能力降低，活性减低的过程称为去活化。,色谱技术,一、氧化铝色谱法,【课堂活动】,模拟实验室氧化铝柱色谱操作，取一色谱柱和适量氧化铝，练习湿法装柱，叙述操作步骤及操作过程中的注意事项。,色谱技术,二、硅胶色谱法,是利用作为固定相的硅胶对混合物中各种成分吸附能力的大小不同，使各成分得到相互分离的方法。,硅胶是一种微呈酸性的多孔性物质。常用SiO2xH2O表示，为硅氧烷交链结构：,色谱技术,二、硅胶色谱法,其骨架表面具有很多硅醇基，使硅胶能与许多化合物形成氢键而产生吸附作用。游离硅醇基数目的多少决定了硅胶吸附作用的强弱。硅醇基也容易通过氢键与水结合，随着含水量的增加，硅胶表面的游离硅醇基数目减少，硅胶吸附其他化合物的能力便随
