《生物化学与分子生物学第二十二章基因结构与功能分析技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学与分子生物学第二十二章基因结构与功能分析技术（64页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第二十二章 基因结构与功能分析技术,DNA序列分析（DNA测序） 基因转录起点分析技术 基因启动子结构分析技术 基因编码序列分析技术 基因拷贝数分析技术,第一节 基因结构分析技术,DNA测序技术诞生,1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert发明了DNA快速测序技术,1980年Nobel化学奖,DNA序列分析,1970年人们就有足够的理论知识来提出目前所用的快速DNA序列分析法。但当时在认识上和技术上存在两个问题： 当时没有能把不同长度的核苷酸片断分离开的技术。 当时的分析思路局限于RNA序列分析法。 （1965年Cornell大学的S.W. Holley等首次测定了
2、75bp的酵母丙氨酸tRNA全序列。使用的是降解片断法）。,Sanger等1977年发明。,Frederick Sanger, 1980年Nobel Prize化学奖,双脱氧链终止法,双脱氧链终止法原理,DNA复制是以一条链为模板，按碱基配对的原则进行的。 脱氧核糖的连接是以35磷酸二脂键。 复制反应可以在体外进行。 2和3双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。,3. Sanger双脱氧终止法测序过程,模板序列,Maxam-Gilbert化学修饰法,1977年，哈佛大学的A.M. Maxam和W. Gilbert发明,Walter Gilbert, 1980年Nobel Prize化学奖,末端放
3、射性标记 的DNA片单链,长度只差一个核苷 酸的DNA链混合物,化学试剂处理,凝胶电泳,放射性自显影,阅读碱基顺序,特定的碱基中 引入化学基团,DNA在被修饰的 核苷酸位置断裂,化学修饰法原理,测序读片,DNA自动化测序,1981年第一台商业化生产的DNA自动测序仪诞生 技术要点： 非放射性标记：荧光物质标记。用激光能激发出不同颜色的荧光 不同的标记对象：既可标记引物，也可标记ddNTP 反应的自动化：Sanger脱氧终止法 读片的自动化：激光探头直接读胶，实时阅读 分析自动化：电脑自动把荧光信号转化成对应的碱基，并打印出DNA序列 反应可在一个试管中进行：标记ddNTP时,荧光标记引物的自动
4、化测序,分别用4种荧光物标记引物 区分反应产物 混合电泳 激光一次读胶 电脑合成结果,荧光标记ddNTP自动测序原理图解,可在同一管中进行,测序结果,（三）焦磷酸测序,是一种基于发光法测定焦磷酸的测序技术 单核苷酸多态性位点（SNP）分析、等位基因频率测定、细菌和病毒等微生物的分型鉴定、CpG甲基化分析、扫描与疾病相关基因序列中的突变点,焦磷酸测序技术操作简单 结果准确可靠 不需要电泳 该方法的测序长度一般短于Sanger法,循环芯片测序被称为第二代测序技术,循环芯片测序（cyclic-array sequencing）, 可实现大规模并行化分析 不需电泳，设备易于微型化 样本和试剂的消耗量降
5、低，降低了测序成本,优势：,技术平台：454测序、Solexa测序（Illumina测序）、SOLiD测序等。,454测序第二代测序技术,测序过程：第一代测序 VS 第二代测序,测序耗时：第一代测序 VS 第二代测序,单分子测序技术被称为第三代测序技术,主要策略：, 通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序，如单分子实时技术（single molecule real time technology，SMRT）； 利用DNA聚合酶在DNA合成时的天然化学方式来实现单分子测序； 直接读取单分子DNA序列信息。,SMRT测序,利用电子显微镜首次拍到DNA照片（2012年底）,一小束DNA得到
6、两个硅柱的支撑,一小束DNA束的电子显微镜照片,第三代测序技术,对穿过纳米孔的DNA直接读取,不断发展的测序技术适应更多元化的需求,第一代测序技术 Sanger测序技术，人类基因组计划主要依赖的技术 第二代测序技术 高通量测序技术，深度测序，用于基因表达谱分析，代替基因芯片技术 第三代测序技术 纳米测序技术，单分子扩增，或直接读取DNA序列 其它： 单细胞测序技术： 多重退火和成环循环扩增（multiple annealing and looping-based amplification cycles ，MALBAC)的技术,二、基因转录起点分析技术,转录起点（transcription s
7、tart site，TSS）,（一）用cDNA克隆直接测序法鉴定TSS,以mRNA为模板，经逆转录合成cDNA第一链，同时利用逆转录酶的末端转移酶活性，在cDNA第一链的末端加上polyC尾，并以此引导合成cDNA第二链。将双链cDNA克隆于适宜载体，通过对克隆cDNA的5-末端进行测序分析即可确定基因的TSS序列。,该方法比较简单，尤其适于对特定基因TSS的分析。但可导致5-末端部分缺失，从而影响对TSS的序列测定。,5-cDNA末端快速扩增技术鉴定TSS,常用的技术包括5-末端基因表达系列分析（5-end serial analysis of gene expression，5-SAGE）
8、和帽分析基因表达（cap analysis gene expression，CAGE）技术。,用数据库搜索TSS,利用对寡核苷酸帽法构建的全长cDNA文库5-末端测序所得的数据信息建立了一个TSS数据库（database of transcription start sites，DBTSS），并在此基础上，通过将寡核苷酸帽法和大量平行测序技术相结合开发了一种TSS测序法，从而实现了一次测试可产生1107 个TSS的数据。,三、基因启动子结构分析技术,（一）用PCR结合测序技术分析启动子结构,该方法最为简单和直接，即根据基因的启动子序列，设计一对引物，然后以PCR法扩增启动子，经测序分析启动子序
9、列结构。,（二）用核酸-蛋白质相互作用技术,1. 用足迹法分析启动子中潜在的调节蛋白结合位点,足迹法（footprinting）是利用DNA电泳条带连续性中断的图谱特点判断与蛋白质结合的DNA区域，它是研究核酸-蛋白质相互作用的方法，而不是专门用于研究启动子结构的方法。,分类：,酶足迹法 化学足迹法,（1）用核酸酶进行足迹分析,酶足迹法（enzymatic footprinting）是利用DNA酶处理DNA-蛋白质复合物，然后通过电泳分析蛋白质结合序列。 常用的酶有DNA酶I（DNase I）和核酸外切酶III。,（2）用化学试剂进行足迹分析,化学足迹法（chemical footprinti
10、ng）是利用能切断DNA骨架的化学试剂处理DNA-蛋白质复合物，由于化学试剂无法接近结合了蛋白质的DNA区域，因此在电泳上形成空白区域的位置就是DNA结合蛋白的结合位点。最常用的化学足迹法是羟自由基足迹法（hydroxyl radical footprinting）。,2. 用电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀技术鉴定启动子,电泳迁移率变动分析（EMSA）和染色质免疫沉淀（ChIP）只能确定DNA序列中含有核蛋白结合位点，故尚需结合DNA足迹实验和DNA测序等技术来确定具体结合序列。,（三）用生物信息学预测启动子,1. 用启动子数据库和启动子预测算法定义启动子,在定义启动子或预测分析启动子结构
11、时应包括启动子区域的3个部分 核心启动子（core promoter）； 近端启动子（proximal promoter）：含有几个调控元件的区域，其范围一般涉及TSS上游几百个碱基； 远端启动子（distal promoter）：范围涉及TSS上游几千个碱基，含有增强子和沉默子等元件。,2. 预测启动子的其他结构特征,启动子区域的其他结构特征包括GC含量、CpG比率、转录因子结合位点、碱基组成及核心启动子元件等。,用于启动子预测的数据库：EPD（eukaryotic promoter databases）数据库，主要预测真核RNA聚合酶型启动子，数据库中的所有启动子数据信息都经过实验证实；T
12、RRD（transcription regulatory region databases）是一个转录调控区数据库，数据来源于已发表的科学论文。,四、基因编码序列分析技术,（一）用cDNA文库法分析基因编码序列,cDNA克隆测序或构建cDNA文库 cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA， RACE） 核酸杂交法,（二）用RNA剪接分析法确定基因编码序列,高通量分析RNA剪接的方法：, 基于DNA芯片的分析法 交联免疫沉淀法 体外报告基因测定法,选择性剪接的转录产物可以通过基因表达序列标签（expression sequence tag, EST）的比较进行
13、鉴定，但这种方法需进行大量的EST序列测定；同时由于大多数EST文库来源于非常有限的组织，故组织特异性剪接变异体也很可能丢失。,（三）用数据库分析基因编码序列,在基因数据库中，对各种方法所获得的cDNA片段的序列进行同源性比对，通过染色体定位分析、内含子外显子分析、ORF分析及表达谱分析等，可以初步明确基因的编码序列，并可对其编码产物的基本性质进行分析。 利用有限的序列信息即可通过同源性搜索获得全长基因序列，然后，利用NCBI的ORF Finder软件或EMBOSS中的getorf软件进行ORF分析，并根据编码序列和非编码序列的结构特点，便可确定基因的编码序列。,五、基因拷贝数分析技术,DNA
14、印迹：是根据探针信号出现的位置和次数判断基因的拷贝数 实时定量PCR：是通过被扩增基因在数量上的差异推测模板基因拷贝数的异同 DNA测序：是最精确的鉴定基因拷贝数的方法,第二节 基因表达产物分析技术,一、通过检测RNA而在转录水平分析基因表达,根据分析方法的原理和功能特性，可将基因转录水平分析分为封闭和开放性系统研究方法。,封闭性系统研究方法（如DNA芯片、RNA印迹、实时RT-PCR等）的应用范围仅限于已知基因。开放性系统研究方法（如差异显示PCR、双向基因表达指纹图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等）可用于发现和分析未知基因。,（一）用核酸杂交法检测RNA表达水平,RNA印迹 核糖核
15、酸酶保护实验分析RNA水平及其剪接情况 RNA酶保护实验（ribonuclease protection assay，RPA）是一种基于杂交原理分析RNA的方法，既可进行定量分析，又可研究其结构特征。,RPA有Northern Blot无法比拟的优点 过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更加完全 RPA比Northern Blot灵敏15150倍，适合检测各种表达水平之基因 RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一情况下的差异表达 一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研究速度,3. 用原位杂交进行RNA区域定位,原位杂交（ISH）是通过设计与目标
16、RNA碱基序列互补的寡核苷酸探针，利用杂交原理在组织原位检测RNA的技术，其可对细胞或组织中原位表达的RNA进行区域定位，同时也可作为定量分析的补充。,（二）用PCR技术检测RNA表达水平,1. 用逆转录PCR进行RNA的半定量分析,逆转录PCR（RT-PCR）一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测RNA样品进行半定量分析。,2. 用实时定量PCR进行RNA的定量分析,实时定量PCR是定量分析RNA的最通用、最快速、最简便的方法，该方法是对PCR反应进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。,（三）基因芯片和高通量测序技术分析RNA表达,1. 基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法,基因芯片主要采用cDNA芯片，其便于对不同状态下的基因表达谱进行比较，揭示转录组差异表达的规律，对探索发病机制、评价治疗效果、筛选药物靶标具有重要意义。,2. 循环芯片测序技术分析基因表达谱,运用循环芯片测序技术，可对基因表达谱进行高通量分析，一次可完成几十
