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1、1,样 本 的 采 集,一、样本的来源和种类 样本是供检出目的微生物或其相关物质的材料。所谓相关物质是指构成目的微生物的核酸脂多糖，蛋白质以及微生物的相应特异性抗体。从预防医学微生物的角度可将微生物分为卫生指标微生物和病原微生物二大类。,2,（一）检出卫生指标微生物的样本来源和种类 卫生指标微生物是指示外环境和食品以及日用品洁净度的微生物可以是单位容积或重量中所含微生物的总数或是以某种代表微生物，它是指示受病原微生物污染情况，如大肠埃希氏菌，粪链球菌和产气荚膜梭菌等，样本的来源是空气、水、食品、药品、化妆品及医院环境等。,3,1. 水样本的采集及处理 采样的容器水样瓶采集前必须进行灭菌并保证在
2、运送保存过程中不受污染。 在采集自来水样时，先用酒精灯将水龙头烧灼消毒、然后将龙头打开，放水510分，再采集水样。 取外环境水样时，应选择有代表性的水源，一般应距水面1015cm深处取样。,4,采集有余氯的水样时，应按每500ml水样加入1.5%硫代硫酸钠2ml，中和水样中的余氯。 采水量为瓶容量的80%，以便在检验时充分震摇水样。 水样作大肠菌群检测时，取水量为350ml。,5,水中病毒检测样本的采集（1）水中病毒数103/L可直接将水样接种细胞无需浓缩，病毒数102/L样本量为15L，=10/L，样本量为1020L，1/100L样本量是5001000L，（2）每次采2份样本，一份及时检测，
3、一份低温保存备用。（3）如为间断污染，采水样时同时还应考虑采集水体底泥及水生生物，特别是贝类样本，因底泥及贝类中病毒可长期存在，并且浓度较高。,6,水中病毒检验样本浓缩处理原则： a. 有较高的和稳定的病毒回收率 b. 不受水质限制，特别是浊度的限制 c. 不受容量限制，可以处理大样本量 d. 操作过程尽可能快，以免损伤病毒 e. 浓集应有选择性，尽可能不浓集病毒以外的物质 f. 操作方法尽可能简单、容易、并且价廉,7,2. 食品中细菌检测的样本采集 食品采集是指在食品原料或成品中抽取具有代表性的样品，并保证这些具有代表性的样本在检验时能完全反映原来的样本状态（在采集与运输过程中排除外界各种干
4、扰），使最终检测结果真实地反映食品本来的卫生状况，因此在作食品细菌学检验中，采样必须注意以下问题：,8,平均样品：粮按三层（表、中、下）五点采样法，油抽取表层与底层油、混样检测。 正常样品与异常样品，除采正常样品外，如发现有异常样本时，也应采样分别进行检测。,9,采样数量：一般采集中样，即从食品的各部分取得的混合样品以200克为准。有些样品可达500克。如粮食可分三层五点，或分层随机采取不同点的样品充分混合后取500克送检。检样也称小样以25克为准。 避免外源性污染，各种采样器、样品容器都需严格灭菌，尽可能从未开启的样品中采样。尽量选样清洁的空间地点，以无菌操作的方式，开启包装，采集样品装入灭
5、菌容器内并将容器密封。,10,防止样品中细菌的菌量及菌相的变化，为了防止样本中细菌的变化，必须严格控制温度，从采样到检验室时间不得超过了3小时，最适温度为04，如为冷冻样品则仍需保持在冷冻状态。 要有明确的标签：样品必须立即贴上标签，表明品名、来源、数量、采样地点采样人及采样年月日地点，必要时注明采样温度、湿度及现场卫生状况，是否无菌操作。,11,国际食品微生物专门委员会（ICMSF）提出食品采样进行检验，应从统计学原理为基础，来考虑对一批食品应检测多少样本，才能具有代表性？目前一般使用的方法是每批样品中只采一个检样进行检验，该批食品是否合格全由一个样品的结果来决定。,12,目前世界粮农组织已
6、采用ICMSF提出的建议作为规定，其中食品中大肠菌群数的检验为一批食品中应采5个样进行检验，而沙门菌则要采10个样来综合判断其卫生状况，现已有加拿大、以色列等国采用此法，作为该国的国家标准。,13,世界粮农组织规定的各种食品微生物的限量标准,14,（二）病原微生物样本的采集 1. 血液样本的采集 （1）血液样本中可能有的细菌 金色葡萄球菌、链球菌、产单核李斯特菌、炭疽杆菌，脑膜炎奈瑟菌、伤塞及副伤塞沙门菌，绿脓杆菌，气单胞菌，鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、钩端螺旋体等。,15,（2）样本采集及应注意事项 采血时期及次数，对血液标本的细菌培养是否能检出病原菌的影响较大。一般情况下，多在病人发热初期或发热
7、高峰时采集。原则上应选择在抗菌药物应用之前，对已用药而不能中止的病人，也应在下次用药之前采集。于用药前24小时内，如采集34次血液标本，其检出率可达90%以上。,16,为了获得正确而检出率高的效果，最好同时采集动脉血和静脉血，或由左右两侧肘静脉同时采集。因为采集部位不同，其血液中的菌数常可不同；同时双部位的标本培养对于检出菌是病原菌，或为污染菌的判定有所帮助。此外，在感染病灶局部附近的血管采集标本，也能提高检出率。,17, 采血部位，一般多由肘静脉采集。采血量一般以培养瓶中培养基量的1/10为宜，如此可使存在于血液中的补体、抗体、调理素及溶菌酶等增殖抑制因子被稀释，使之减弱或失去抑制作用。对于
8、应用抗菌药物中的病人血液，以培养基量的1/20为宜。成人一次采血为510ml，婴幼儿为12ml。,18,采血部位的局部皮肤应彻底消毒，通常先用碘酒棉涂布消毒，干后消毒酒精（70%）揩拭。操作时，应以穿刺部位为中心逐渐向外延伸消毒。,19,血液标本的细菌学检验，一般不用抗凝剂，因为氟化钠、EDTA，枸橼酸钠可对细菌不利。近年来，认为在培养基中加入0.030.05%聚茴香脑碘酸钠（sodium polyanethol sulfonate，SPS）效果较好，具有抑制血清中杀菌物质的作用，并且对氨基糖苷类及多肽类抗生素有灭活效果，有利于细菌的检出。肝素抗凝尚未见对细菌有所影响。,20,通常无菌采集血液
9、后立即注入装有液体培养瓶。所用的培养基随检验目的和习惯不同。目前主张，对病人已用过抗生素或碘胺类药物时，培养基每100ml中加对氨基苯甲酸5mg以对抗磺胺类药的作用，加入青霉素酶200单位以对抗青霉素的作用。若病人已用其他抗生素治疗，常用加入硫酸镁的培养基，以中和链霉素、四环素、土霉素、金霉素、新霉素及多粘菌素等抗菌药物。,21,2. 粪便样本的采集 （1）粪便中可能发现的细菌 葡萄球菌、粪链球菌、产气荚膜梭菌、结核分技杆菌、伤寒、副伤寒及其他沙门菌、志贺菌、变形杆菌、绿脓杆菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、假丝酵母菌等。 （2）样本的采集,22,【操作】 选取有脓血、粘液部分的粪便23g，液体粪便
10、则取絮状物，盛于灭菌的广口瓶或蜡纸盒中，及时送检和接种,23,在无法获得粪便的情况下，可用经无菌生理盐水（或保存液）或增菌用湿润的直肠拭子插入肛门45cm深处（小儿23cm），轻轻转动一圈，擦取直肠表面的粘液后取出，盛入无菌试管或保存液中送检。,24,粪便标本的采集应注意下述问题： 粪便标本应尽量在病程早期和治疗前采集。疾病急性期致病菌往往占优势，以后数日即迅速减少；一般认为，服用抗菌药物3d，标本中病原菌即转阴性。,25,应采集新排出的新鲜粪便。若无法获得时，可作采便管或直肠拭子采集。采集时要注意先取有脓血、粘液、上皮碎片等病理成分。一般固体标本采23g，液体标本采13ml盛于小盒或试管中及
11、时送检。,26,标本采集后需立即送检，拖延送检可致病原菌数目迅速减少或杂菌过度生长，影响病菌的检出率，不能及时送检时，应将标本置于保存液或运送培养基中送检。,27,（三）病毒样本的采集 1. 流行性感冒病毒样本 采集和处理 采集时间应在病人发病后头3d，越早越好，虽然有的发病后7d采集的标本还能分离到病毒，但随时间延长分离率大大地下降。较好的标本为鼻腔洗液，但病人不易接受，尤其小孩不易协作，故常用咽喉和鼻拭子或咽喉漱液即用灭菌的棉拭子涂擦患者的咽部，,28,有时用另一根棉拭子涂擦患者的鼻腔，然后将棉拭子浸入5ml灭菌的pH7.2的肉汤或Hank液或生理盐水中，有时可让成人患者先咳嗽几声，而后用
12、10ml漱液反复含嗽咽部约1min再吐入管中。从疑似流感死亡的病例中取样时，应取肺，气管粘膜和血。采集的标本应马上放冰壶中，以冷的状态送到实验室越快越好，如48h内未能进行接种，标本应放低温（最好-70）以下进行保存。鼻腔或咽部洗液送到实验室后，,29,用手将装标本的管充分振荡，将粘液打碎，置4510min，待其自然沉淀，取上清液3ml按每毫升青霉素1000u，链霉素1000g，混匀置42h后就可接种。含棉拭子的标本，先将棉拭子在管壁反复挤压后取出，而后按上述加以处理。器管组织标本，需先用灭菌的乳钵磨碎用生理盐水配成200g/L县液，离心沉淀，取3ml上清液与上述一样用青、链霉素处理之。,30
13、,2. 脊髓灰质炎病毒样本 （一）标本采集 标本的采集应尽快进行，常在患者发病7d内采集，采集后的标本低温送检（4），低温保存（-25）。粪便标本是最为常用的标本。可取患者粪便（即48g），置于干燥、洁净、不漏的容器内，保存送检。,31,肛拭子与咽拭子标本可放入12ml无菌营养液或Hank液中送检，保存。 脑脊液23ml，直接放入灭菌管内送检，保存。 尸体解剖标本采集要考虑取中枢神经系统（特别是颈和腰部的脊髓灰质和桥脑）和降结肠标本，置于灭菌容器内，保存送检。,32,（二）标本处理 粪便标本2g加Hank液10ml制成20%悬液。3000r/min离心30min，取上清45ml，加活性炭200
14、250mg混匀，41h后，3000r/min离心30min，取上清加抗生素（终浓度每毫升1000u青霉素，1000g链霉素，下称“双抗”）4作用4h，接种肉汤培养。如有细菌生长，重复处理一次。处理好的标本-20保存。,33,肛拭子标本同粪便标本处理相同。 咽拭子标本的处理只需加抗生素作无菌试验阴性，即可-20保存。 尸体解剖标本1g，加入5ml Hank液，研磨成悬液，3000r/min，离心30min，取上清加双抗（终浓度每毫升500u 青霉素和500g链霉素），4过夜，离心，取上清-20保存。,34,3. 流行性出血热病毒的样本 (一)样本的采集 1鼠肺 将捕到的新鲜死鼠或活鼠(颈动脉放血
15、致死)，置35来苏儿浸泡510min，用碘酒消毒背部(或前胸)皮毛，无菌解剖取出肺脏，分成大小两份分别编号，,35,小份制冰冻切片作间接免疫荧光染色；大份置4冰箱或一20以下低温冰箱暂时保存。选择特异性免疫荧光强阳性标本，可制成10悬液供分离病毒用。其他动物脏器标本制备方法与鼠肺的相同。,36,2病人血液 采血应在病人发病后5d内，愈早愈好。无菌采静脉血5ml，放冰壶内立即送实验室，分离血清(如将血液4保存，不应超过24h，将血清和血块分别冻存于一40C以下或液氮中备用。,37,选双份血清抗体检查确诊病例的第1份血清标本(最好是抗体反应阴性的血清或血块)作病毒分离标本之用。血清可直接用于接种细
16、胞或动物，血块经研磨制成5悬液后应用。另外有采用“床边接种”，即采血后立即将全血接种到敏感动物或细胞，因标本新鲜，有可能提高分离率。,38,有人采用病人的白细胞分离病毒，获得良好结果。分离白细胞的方法是：用注射器先抽取肝素lml，用它可采病人静脉血510ml，置试管内混匀，再加入60gL葡聚糖1份于5份含肝素的全血中，于30C静置30min后，将上清液离心10min(1 500rmin)，用Hank液洗沉淀2次，再用Eagle液稀释白细胞到一定浓度后，直接接种敏感动物或细胞培养。,39,（二）样本的处理 1除菌 鼠肺、病人血液(血清、血块、血细胞)要求严格无菌手术采取，制备悬液时加含常规量抗生素防少量杂菌生长外，一般不需其他处理。对从外环境采集的标本(如螨类)或在操作中无菌条件不够，污染杂菌可能性大时，,40,用含大剂量抗生素(100010000u或/g/m1青霉素、链霉素和适量制霉菌素)的缓冲液处理过夜或将悬液标本经1000
