《《专题2课题2土壤中分解尿素的细菌的分离和计数》(共46张)课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《专题2课题2土壤中分解尿素的细菌的分离和计数》(共46张)课件（46页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、尿素分子的立体结构,CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3,脲酶,课题2,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,1、常见的分解尿素的微生物,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。,2、课题目的,一、从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,二、统计每克土壤样品中尿素细菌的数目,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,. 筛选菌株,PCR技术是一种常用的DNA扩增技术，此项技术的自动化，需要使用耐高温的DNA聚合酶，如果请你来找这种耐高温的酶，你会去哪里找？,热泉70-80摄氏度的高温条件淘汰了绝大多数微生物，而耐热的
2、Taq细菌脱颖而出。,水生耐高温细菌Taq,1、实验室微生物的筛选原理（P21）,人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。,（一）筛选菌株,一、研究思路,2、选择培养基,在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。,（一）筛选菌株,一、研究思路,加入青霉素的培养基 细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长 不加含碳有机物的无碳培养基 分离自养型微生物,1.在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是是什么物质？,碳源是葡萄糖，氮源是尿素,2.分析该配方的培养基对微生物是否具有选择作用
3、？如果有，又是如何进行选择的？,有筛选作用。尿素是培养基中的唯一氮源，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。,阅读22页本课题使用的培养基配方,二、统计菌落数目,显微镜直接计数法 稀释涂布平板法（活菌计数法）,（二）微生物计数,1、显微镜直接计数法,1mm,一、研究思路,每一个大方格边长为 1mm ，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。,1mm,下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数是多少? 1ml菌液中的总菌数?(1ml=
4、1cm3=1000mm3）,5AB104,5A,缺点： 不能区分死菌与活菌,2、统计菌落数目稀释涂布平板法,（二）微生物计数,平板菌落数统计注意事项,1、几个菌落粘连一起，只要肉眼能区分，就算几个； 2、不管菌落大小，只要肉眼看得见，就应该计数； 3、菌落数目过多时，可以合理采用样方法。,某班级菌落数统计表格,平板,组别,恰当的稀释度、正确的涂布操作是成功地统计菌落数目的关键。,（取样0.1mL,稀释倍数106）,14,【例1】某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL） A.2.34108 B.2.
5、34109 C.234 D.23.4,思考1：如何根据平板上的菌落数推测出每mL样品中的菌株数？,【解析】选B。稀释倍数为106，0.1 mL稀释液的菌落数的平均值为234，则每毫升样品中菌落数就为234/0.1106= 2.34109。,每mL样品中的菌株数=（CV）M,C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V：涂布平板时所用的稀释液的体积 M：稀释倍数,思考2：为什么测平板上的菌落数可以推测样品中的活菌的数目？,当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约有多少活菌。,为了保证结果准确，一般选用菌落数在303
6、00的平板进行计数。,思考3：统计的菌落数往往比活菌的实际数目高还是低，为什么？,低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。,第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因 此结果不具有说服力。 第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在 操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平 板的计数值用来求平均值。,实例分析1,启 示,在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。 在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否
7、一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,实例分析2,想一想：A同学和其他同学所得实验结果差异 如此之大，请分析原因可能有哪些？,实例分析2,想一想：你能通过设置对照，帮助A同学排除 上述两个可能影响实验结果的因素吗？,一种方案： 可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验。 如果结果与A同学一致，则证明A无误； 如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,实例分析,想一想：你能通过设置对照，帮助A同学排除 上述两个可能影响实验结果的因素吗？,另一种方案： 将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,实验结果要有说服力，对
8、照的设置是必不可少的！,实例启示,设置对照实验的目的是什么？,排除实验操作、培养条件等无关变量对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,（三）实验基本原则,1、平行重复原则,2、对照原则,3、单一变量原则,一、研究思路,实验名称：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 实验原理： 实验目的： 材料用具： 方法步骤：1、分组编号 2、处理（遵循实验设计的基本原则） 对照原则、单一变量原则（等量原则） 科学性原则、平行重复原则 可行性原则 3、观察记录（设计观察记录表） 实验预期： 实验结果的分析与评价： 实验结论：,设计时请利用P23-P24的三个资料,二、实验设计,实验名称：土壤中分解尿素的细菌的分
9、离与计数 实验原理： 实验目的： 材料用具： 方法步骤：1、分组编号 2、处理（遵循实验设计的基本原则） 对照原则、单一变量原则（等量原则） 科学性原则、平行重复原则 可行性原则 3、观察记录（设计观察记录表） 实验预期： 实验结果的分析与评价： 实验结论：,设计时请利用P23-P24的三个资料,二、实验设计,实验设计,实验名称： 实验目的： 实验原理： 实验用具：,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,将土壤中能够分解尿素的细菌筛选出来，并进行统计分析。,1.提供以尿素作为唯一氮源的培养基，原则上只有能分解尿素的培养基才能生长。,小铁铲、信封、酒精灯、培养皿、试管、试管架、移液管、胶头滴管、蒸馏
10、水、选择培养基、牛肉膏蛋白胨培养基等。,2.当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。,实验设计,土壤中分解尿素的细菌的分离与记数,1.土壤取样,3.样品稀释、取样涂布,4.微生物的培养、观察并记录结果,5.细菌的计数,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,实验步骤,1土壤取样,制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基，准备好无菌试管和移液管。,实验步骤,2.制备培养基,制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基，准备好无菌试管和移液管。 注：每个稀释度下需要3个选
11、择培养基（平行重复原则），1个牛肉膏蛋白胨培养基。选用稀释倍数为103107的稀释液。,实验步骤,2.制备培养基,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,因为土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,测定土壤中细菌的数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一
12、般选用103、104和105倍稀释液；测定真菌的数量，一般选用102、103和104倍稀释液。,注： 样品的稀释,将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中,充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL水的无菌试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107至103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。,实验步骤,3.样品稀释、取样涂布,注意：由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103107。,将涂布好的培养皿放在30下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录
13、。,4.微生物的培养、观察并记录结果,不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在3037的温度下培养12d；放线菌一般在2528的温度下培养57d；而霉菌一般在2528的温度下培养34d。,注：,一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征。,当菌落数目稳定时，选取菌落数在30300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。,实验步骤,5.细菌的计数,操作提示,一无菌操作 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2、应在火焰旁称取土
14、壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 二做好标记 注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。 三规划时间,课题延伸,CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3,脲酶,pH升高 指示剂（酚红）将变红,挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基 的斜面中，观察能否变红。,1、结合对照，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。 2、是否获得了某一稀释度下，菌落数目在30300的平板。在这稀释度下，是否至少有两个平板的菌落数相近？ 3、你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？,结果分析与评价,滤膜法,以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例。将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养液基上培养。在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色。可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。,微生物计数,（一）空气中微生物总数的检测 （二）水中细菌总数的检测 （三）牛奶中细菌的分离与计数 （四）土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数,六、相关链接,
