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1、2019年6月4日星期二,色层分析法,1,第 四 章 色层分析法,2019年6月4日星期二,2,色层分析法提纲,吸附层析 分配层析 亲和层析 凝胶层析 实验技术,色层分析法最早始于1903年-茨维特的实验,概述,2019年6月4日星期二,概述,1931年,R.Kuhn 等人分离复杂的有机混合物 1941年, 英国学者Martin和Synge，分配层析概念以及液-液分配层析的塔板理论。,分离乙酰化氨基酸混合物,2019年6月4日星期二,5,概述,1944年, Consden、Cordon和Mactin，纸层析。 1949年，Macllean等，薄层色谱法。 1952年，Martin和Synge，
2、气液色谱法产生。Martin和Synge获得1952年的诺贝尔化学奖 50年代开始, 出现了气相层析、液相层析、高效液相层析、薄层层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等,层析法和其它技术的联用。,2019年6月4日星期二,6,色层分析法是由流动相，带着被分离的物质流经固定相，在移动过程中，各种溶质受到固定相不同程度的作用，从而使试样中的各种组分分离。,色层法应具备的因素或条件是： 1. 具有两相 2. 混合物中各组分的物理化学性质有差异 3. 多次冲洗或展开,2019年6月4日星期二,9,柱层析：固定相装填在管中成柱形，在柱中进行的层析分离； 纸层析：利用滤纸作为固定相的层析分离； 薄层层析
3、：固定相在玻璃板、铝膜等支持物上铺成薄层的层析分离。,按固定相的装填方式分类,2019年6月4日星期二,10,根据分离的原理分类,2019年6月4日星期二,11,一吸附层析 （adsorption chromatography）,1.原理 2.吸附剂的类型及其选择 3.流动相及其选择,2019年6月4日星期二,12,吸附 在固体或液体内部或表面的选择性传递。 溶质:被吸附的物质，吸附剂:固体材料,1原理,2019年6月4日星期二,13,混合物随流动相通过吸附剂组成的固定相时，在固定相和流动相作用下发生吸附、脱附、再吸附、再脱附的反复过程，由吸附剂对不同物质的不同吸附力而使混合物分离的方法。,吸
4、附层析,根据所用吸附剂和吸附力的不同，吸附色谱可分为： 无机基质吸附色谱(多种作用力) 疏水作用吸附色谱(疏水作用) 共价作用吸附色谱(共价键) 金属鳌合作用吸附色谱(鳌合作用) 聚酰胺吸附色谱（氢键作用),2019年6月4日星期二,15,吸附等温线：在一定温度下，某种组分在吸附剂表面达平衡状态时在两相中浓度的相对关系曲线。 分配系数KD,2019年6月4日星期二,16,吸附等温线,线形,非线形,2019年6月4日星期二,17,2吸附剂的选择,高选择性以实现很好分离； 高容量以减少吸附剂的使用量； 对于快速吸剂具有很好的动力学和传递特性； 具有化学和热稳定性； 具有一定的机械强度和惰性； 易于
5、充填或铺层； 抗污染性强； 价格便宜。,2019年6月4日星期二,18,活化 吸附剂一般可分为极性和非极性两类。 极性吸附剂：氧化物、氢氧化物和盐 非极性吸附剂：活性碳，硅胶等 影响吸附剂性质因素：化学结构、吸附剂的溶剂化作用以及吸附剂的预处理、吸附剂的物理状态,吸附剂对有机物的吸附作用有多种形式,2019年6月4日星期二,19,非极性或弱极性有机物:范德华力，吸附较弱； 极性有机物:偶极力或氢键作用，有时还有成盐作用。 作用的强度依次为： 成盐作用 配位作用 氢键作用 偶极作用 范德华力作用。 有机物的极性越强，在氧化铝等上的吸附越强。,2019年6月4日星期二,20,根据吸附剂和被吸附物质
6、理化性质：极性强的吸附剂易吸附极性强的物质、非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。 为了便于解吸附，分离弱极性的组分选用极性强的吸附剂，分离极性较强的组分应选用极性小的吸附剂。 常用的吸附剂有Al2O3，硅胶，羟基磷灰石，聚酰胺等。,吸附剂选择,2019年6月4日星期二,21,（1）硅胶,硅胶是由聚硅酸脱水制得的颗粒状吸附剂,2019年6月4日星期二,22,活化：在加热min活化 不同形式（H/G/F） 粘合剂（煅石膏：牢度差，不能用于分离无机物；羧甲基纤维素：牢度好，不能用腐蚀性显色剂；淀粉：不能用于分离有机物） 硅胶具有微酸性，可用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、甾体激素、类脂，萜类及
7、色素等物质，硅胶用量一般是样品量的倍。,硅胶,2019年6月4日星期二,23,（2）氧化铝,Al2O3是由Al(OH)脱水制得，Al2O3表面存在铝羟基Al，键作用。 l2O3可分为中性、酸性、碱性三种。中性氧化铝适用于醛、酮、酯、内酯化合物及某些苷的分离；酸性氧化铝适用于酸性化合物；碱性l2O3适用于分离碱性化合物。 能用酸性或碱性氧化铝分离的物质也可用中性的氧化铝分离。 l2O3用量为样品量的5倍。,2019年6月4日星期二,24,2019年6月4日星期二,25,（3）羟基磷灰石,化学式Ca5(PO4)3OH2，简称HA。 国外的BioRad公司生产的HA有三种规格 在T85，pH5.5-
8、10.0均可使用。 Ca2基团和生物表面的负电荷基团的相互反应 PO43-基团与生物分子表面的阳电荷基团相互反应。,参考书：生物化学技术原理及其应用,2019年6月4日星期二,26,（4）聚酰胺,由己内酰胺聚合而成，层析用聚酰胺是白色多孔性的非晶形粉末，对碱比较稳定，对酸的稳定性较差。 聚酰胺分子内存在着很多的酰胺键，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键。 各种化合物因其与聚酰胺形成氢键能力的不同，吸附能力也就不同，因此可以得到分离。,20世纪60年代未在离子交换剂和其它吸附剂应用的基础上发展起来的一种新型树脂。 一种具有多孔立体结构，人工合成的有机高分子聚合物。 多孔网状结构，巨大的比
9、表面积使其具有良好的吸附性能。,（5）吸附树脂（Macroporous Resin，MR）,5.1 合成方法,苯乙烯,+,二乙烯苯,甲苯 二甲苯,+,悬浮共聚,抽提出甲苯二甲苯,树脂珠体,0.5%的明胶溶液,溶剂 抽提,室温 晾干,25真空 干燥,成品,其中：苯乙烯为聚合单体 二乙烯苯为交联剂 甲苯、二甲苯为致孔剂,以聚苯乙烯系列为例,聚苯乙烯类合成,国产树脂的主要类型,致孔剂：甲苯、石蜡、溶剂汽油、煤油、碳醇、聚乙烯醇等,聚苯乙烯系列合成树脂： Diaion: HP20, HP21 Sepabeads: SP825, SP850 Sepabeads: SP70, SP700 修饰的聚苯乙烯系
10、列合成树脂: Sepabeads: SP207 异丁烯系列合成树脂: Diaion: HP2MG,三菱化学的大孔吸附树脂,进口树脂的主要型号,美国：XAD系列 日本： Diaion HP和SP系列 Porapak系列 Chromosorb系列,5.2 主要理化性质,性状：白色、乳白色至微黄色颗粒 粒度：20-60目。 稳定性：不溶于水、酸、碱及有机溶剂，加热不溶，可在150以下使用。 含水量：40-75%。,1非极性吸附树脂：为苯乙烯-二乙烯苯聚合物 Amberlite XAD-4 Diaion HP-20 上海试剂厂的D101、D102、D401 南开大学的D1、D2、D3、D4 2中等极性
11、吸附树脂：为聚丙烯酸酯型聚合物 Amberlite XAD-6、XAD-7、 XAD-8 3极性吸附树脂：含硫氧、酰胺等基团 Amberlite XAD-9 ；南大化工厂的X-5、S-8 天津试剂二厂的GDX-501、GDX-601等 4强极性吸附树脂：含氨基、吡啶、氧化氮等极性基因 Amberlite XAD-11、Amberlite XAD-12、天津试剂二厂的GDX-402、GDX-403等,5.3 类型,2019年6月4日星期二,35,新型吸附树脂氢键型吸附树脂,依靠与被吸附物质之间形成氢键而实现选择性分离 ADS-17，它能与黄酮类、多元酚类形成氢键 ADS-21，酰胺基聚苯乙烯结构
12、，可与酚、多元酚、取代酚类和黄酮类化合物的羟基形成氢键。对含有酸性酚羟基的化合物在酸性和弱碱性条件下均能保持良好的吸附性能。 ADS-F8，凝胶氢键型极性吸附树脂，对黄酮类、多元酚类有较高的吸附选择性。,2019年6月4日星期二,36,不同吸附树脂对GBE的分离效果,2019年6月4日星期二,37,用吸附树脂制备的黄酮类提取物,红花黄色素HSYA 多羟基黄酮，极易溶于水,邻氨基-羟基吸附树脂,2019年6月4日星期二,40,新型吸附树脂离子偶极型吸附树脂,具有疏水性和离子偶极作用的双功能吸附树脂 ADS-7，聚苯乙烯结构、强极性吸附树脂，兼具吸附和脱色两种功能。,2019年6月4日星期二,41
13、,不同树脂对穿心莲内酯的提取效果,2019年6月4日星期二,42,新型吸附树脂色层分离的选择性吸附树脂,基于“强吸附弱吸附”的差别，以适当的流动相使混合物中不同的成分先后流出树脂柱外，得到纯的单一物质。,2019年6月4日星期二,43,新型吸附树脂非水体系的吸附树脂,用于水难溶或不溶的中药成份的吸附分离。 ADS-13从氯仿溶液中吸附分离长春碱，作用原理是形成氢键的作用。 ADS-7从有机溶剂中吸附脂溶性的黄酮和多元酚类物质，作用原理是离子偶极作用。 ADS-M从有机溶剂中吸附生物碱类，作用原理是络合作用。,2019年6月4日星期二,44,新型吸附树脂分子筛吸附树脂,除去分子量较小的杂质，提高
14、分子量较大的有效成分的含量。 除去提取物中的农药残留。,5.4 吸附树脂的一般特性,2019年6月4日星期二,45,5.4.1 吸附质的分子大小与树脂孔径 吸附质通过树脂的孔道而扩散到树脂的内表面被吸附，树脂孔径的大小直接影响不同大小分子的自由出入，从而使树脂具有选择性。因此，只有当孔径对于吸附质足够大时，比表面积才能充分发挥作用。 以头孢素C为例，用Amberlite XAD-4和 SIP-7300型进行比较，尽管前者比表面积大，但平均孔径小，因此吸附速度较慢，解吸不够集中，杂质的分离效果也较差。,5.4.2 树脂的强度,MR强度与孔隙率有直接关系，也和制备工艺有关，一般树脂孔隙率越高，孔体
15、积越大，则强度越差，树脂的强度直接影响树脂的使用寿命，从而影响着树脂工艺法的成本。,5.4.3 吸附物性质与树脂极性选择,遵从类似物质吸附的“相似相容”原则，根据吸附物的极性大小选择不同类型的树脂,树脂,非极性树脂：从极性溶液中吸附非极性物质,极性树脂,弱极性：极性溶液吸附非极性物质,极性：极性吸附极性,中等极性：极性吸附非极性 非极性吸附极性,5.5 大孔吸附树脂的应用实例,2019年6月4日星期二,48,成分的类型与树脂的选择,脂溶性成分包括甾体类、二萜、三萜、黄酮、木脂素、香豆素、生物碱等：应选择非极性或弱极性的树脂，如D101、AB-8、HPD100等 皂苷和生物碱苷类成分：应选择弱极
16、性或极性树脂，如D201、D301、HPD300、HPD600、AB-8、NKA-9等 黄酮苷、蒽醌苷、木脂素苷、香豆素苷等：应选择合成原料中加有甲基丙烯酸甲酯或丙烯氰的树脂，如D201、D301、HPD600、NKA-9等 环烯醚萜苷类成分：应选择极性树脂，如D301、HPD600、NKA-9等,2019年6月4日星期二,50,实例. 槐花米中黄酮苷类成分的分离、纯化,槐花花穗 9.9kg,MeOH提取 36L,HP20 吸附,MeOH溶解 50-10L+100%-10L,LH-20吸附 MeOH溶解,CHP20P吸附 50%EtOH流份,ODS层析分离 45%MeOH洗脱,3,4,5,7-四羟基黄酮- 3-葡萄糖酸苷,实例 绞股蓝总皂苷的精制,绞股蓝 水煎液,D101树脂,水洗脱,弃去,95乙醇洗脱,收集洗脱液 浓缩得总皂苷,实例 贯叶金丝桃提取物制备中的应用,贯叶金丝桃 80乙醇提取物,正己烷 脱脂,
