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1、1新型重组人肿瘤坏死因子药代动力学的实验方法作者：赵宁张英起王增禄刘昌孝陈拯民顾以保蔡永明高连用李全胜曾勇【关键词】肿瘤坏死因子 关键词:肿瘤坏死因子 ;药代动力学;放射测量术;HPLC;ELISA摘要:目的为探讨新型重组人肿瘤坏死因子（nrTNF）药代动力学而建立生物样品中 nrhTNF 的检测方法.方法方法（RA）:动物肌注 125标记的nrhTNF 后，测定各生物样品中的总放射活性;方法（HPLC-RA）:上述生物样品先经 HPLC 分离后，收集并测定其中 125-nrhTNF 部分的放射活性;方法EILISA 法.结果 RA，HPLC-RA 法检测的 nrhTNF 质量浓度与放射性呈直
2、线相关（RA，r=0.999HPLC-RA，r=0.999）.ELISA 法证明 rhTNF 的酶联免疫检测药盒适用于 nrhTNF 的检测，rhTNF 的标准曲线与 nrhTNF 的标准曲线显正相关，r=0.994.这一检测系统与其他细胞因子包括 IFN，TNF，IL-2 和 IL-6无交叉反应.结论 RA，HPLC-RA 和 ELISA 法均可作为 nrhTNF 的药代动力学实验方法.Keywords:tumornecrosisfactor-alpha;pharrmacokinetics;radiometry;HPLC;ELISAAbstract:AIMToestablishthreeme
3、thodsofdetectingnrh-TNFinbiologicalsamplesforinvestigatingthepharma-cokineticsofnrhTNF.METHODSMethodI（RA）:Mea-suringthetotalradioactivityinbiologicalsamplesafter125-nrhTNFadministrationbyiminjectiontoanimals.Method（HPLC-RA）:Collectingandmeasuringtheradioactivityof125-nrhTNFaftersamplesseparatedbyHPL
4、C.Method:ELISA.RESULTSThemassconcentrationsofnrhTNFmeasuredbyRAandHPLC-RAhadstraightlinecorrelationwiththeirradioactivity.ItwasdemonstratedthattherhTNFELISAkitwassuitablefornrhTNFdetectionandbothstandardcurvesofrhTNFandnrhTNFhadagoodpositivecorrelationwithacorrelationcoefficientof0.994.TheELISAsyste
5、mshowednocrossreactionwithanyothercytokinesincludingIFN，TNF，IL-2andIL-6.CONCLUSIONThreemethods（RA，HPLC-RA，andELISA）establishedfordetectingnrhTNFinbiologicalsampiscouldbeusedaspharmacokineticmethodsofnthTNF.0 引言肿瘤坏死因子（TNF）是当代的研究热点1-10.实验方法对药代动力学研究是至关重要的.测定方法的特异性、灵敏度和准确性是研究的基础，对于基因2工程表达的多肽类药物更是如此，因为它不
6、但受体内大量物质的干扰，而且由于药物剂量很小（g） ，体内浓度又极低，这就加大了测定的难度.为了对新型肿瘤坏死因子进行药代动力学研究，我们参考文献方法11-14建立了相应的药代动力学实验方法.1 材料和方法1.1 材料新型重组人肿瘤坏死因子（简称 nrhT-NF）由第四军医大学生物技术中心提供，纯度经 GFC-HPLC 分析鉴定纯度为 97.5%;昆明种小鼠，雌雄兼用，体质量 1822g，由天津药物研究院动物室提供;仪器 HPLC 及 BiosepSEC-S3000柱为美国 Phenmenex 公司产品;-计数器 FT-630 型为北京核仪器厂出品;450 型酶标仪为美国 BioRad 公司产
7、品;ELISA 试剂盒由第四军医大学免疫学教研室提供.1.2 方法1.2.1 放射活性测定（RA）法标准曲线的制备以 1000gL-1nrhTNF 标准液（0.05molL-1 磷酸缓冲液，7.40108BqL-1的 125I-nrhTNF）配成质量浓度为 0.02，0.1，0.5，4，20 和 100gL-1 的应用液，各取 20L 置于测定管中，-计数器测定，将质量浓度与计数值（cpm）绘成标准曲线.按照标准曲线方法分别做血清、脑、脂肪、心、肌肉、肝、脾组织中 125I-nrhTNF 的校正曲线.1.2.2HPLC 分离结合放射活性测定（HPLC-RA）法标准曲线按 RA 法中标准曲线制备
8、方法配制成应用液，各取 10L 经 SECS3000 柱在 HPLC 上分离，收集固定时间的洗脱液，置于测定管中，在 -计数器上计数，将浓度与计数值（cpm）绘制成标准曲线.以同样方法制备血清中 nrhTNF 的校正曲线，并测定质量浓度为 0.5，4.0，20.0gL-1 时血清样品经 HPLC 分离后 nrhTNF 的量，以计算回收率.1.2.3 酶联免疫测定（ELISA）法采用第四军医大学免疫学教研室 rhTNF试剂盒，以一株 mAb 包被 96 孔板，4过夜，样品和标准品均做复孔，每孔加样100L.另一株 mAb 作酶标抗体，加 TMB 于 37反应 15min 后以 2molL-1 硫
9、酸终止反应，在酶标仪上测定各孔的吸收度，检测波长为 450nm，给药小鼠或正常对照小鼠眼眶取血，室温放置 30min 后于 4000rmin-1 离心15min，分离出血清，立即加入甲基氟磺酸至 1mmolL-1，-20保存，当天样品 24h 内测定完毕.以0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800，1.600gL-1nrhTNF做血清中 nrhTNF 的标准曲线.2 结果采用 Iodoge 法进行标记的 125I-nrhTNF 经 sephacrylS-200HR 柱纯化后放射活性浓度为 14.80108BqL-1，放射比活性为15.90108BqL-1，放射化学
10、纯度在 95%以上.2.1RA 法标准曲线和校正曲线表明，nrhTNF 质量浓度与 cpm 呈直线相关，3标准曲线方程为 Y=8.4+533X（r=0.999） ，血清、脑、脂肪、心、肌肉、肝和脾组织的校正曲线方程分别为:Y=7.5+513X（r=0.999，血清） 、Y=8.2+688X（r=0.994，脑） 、Y=5.0+653X（r=0.999，脂肪） 、Y=12.3+618X（r=0.999，脾） 、Y=14.5+651X（r=0.996，肌肉） 、Y=0.5+671X（r=0.995，肝） 、Y=12.3+618X（r=0.999，心）.从血清中直接测定nrhTNF 的回收率（Tab
11、1） ，其批内和批间测定精密度良好（Tab2） ，变异系数（CV%）符合实验要求，检测灵敏度为 0.01gL-1.表 1 血清中 125I-nrhTNF 的回收率略表 2 血清中 125I-nrhTNF 测定精密度略2.2HPLCRA 法标准曲线和校正曲线显示，质量浓度与 cpm 值呈直线相关.标准曲线方程为 Y=13.5+642X（r=0.999） ，血清校正曲线方程为Y=7.1+720X（r=0.999）.该法回收率较好（Tab1） ，在 0.520gL-1范围内其回收率均在 95%以上，批内和批间测定精密度（CV%）均符合实验要求（Tab2） ，检测灵敏度为 0.02gL-1.2.3EL
12、ISA 法用 rh-TNF 的 ELISA 药盒可以测定血清中 nrh-TNF 的含量.用该药盒制备的 rh-TNF 标准曲线二者呈正相关，相关系数为 0.994，当血清中 nrh-TNF 浓度范围在 0.0251.600ng 时其浓度的对数（lgc）与显色后的吸光度值（A）呈直线相关，校正曲线方程为 lgc=1.372+1.022A（r=0.996）.本法的最低检测浓度为 0.025gL-1.nrh-TNF 的质量浓度为 0.1，0.50和 1.00gL-1 时的批内变异系数均小于 2.33%，血清中 nrhTNF 质量浓度为 0.05，0.50 和 1.00gL-1 时的回收率均大于 72
13、%.本法具有较高的特异性，与 IFN，IFN，IL-2 和 IL-6 等其他细胞因子均无交叉反应.3 讨论对于药代动力学研究，被试药物的检测方法是至关重要的，不但要求检测方法可靠、灵敏、重复性好，而且要求特异性强，往往单一方法不完全具备这些特点，而采用几种方法联合应用，以达到药代动力学的要求.我们建立的 RA 法，其检测灵敏度、精密度良好，但其专一性较差，因为它测定的是总放射活性，除了125I-nrhTNF 外，还包括 125I-nrhTNF 降解产物，甚至脱落的同位素，即总放射活性不能完全代表原型（未降解）药物.只有将色谱方法与同位素法相结合，将带同位素的药物（125I-nrhTNF）和非药
14、物分离后，才能测得真实的原型药物浓度，使实验方法的灵敏性和准确性得以提高，增加实验结果的可靠性，所以我们选用了 HPLC-RA 法，但该法较复杂，测定周期长，需要贵重仪器，特别是测定大量样品时问题更为突出.而 ELISA 法更能可靠反映原型药物的特异性.但其检测灵敏度明显逊于前两种方法.总之，RA、HPLC-RA 和 ELISA3 种方法均可用于检测生物样品（血清）中 rnhTNF 的含量，做为药代动力学研究，除了 RA 法外就能反映原型药变化的 HPLC-RA 和 ELISA 法相互印证为好.致谢我校免疫学教研室金伯泉教授、刘雪松、李琦和杨琨同志给予的大力支4持和帮助.参考文献:1XuP，Y
15、iDH，ChenP，WangHS，HouXB.Expressionandlo-calizationofTNF-mRNAingastricmucosaofCPBrabbitJ.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthMilMedUniv） ，2000;21（5）:636-639.2GuoZ，HuYY，LuR，WangJ.ThemodulationofBMPonex-pressionofTNF-andIL-6geneintheareaofimplantedxeno-geneicboneJ.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthMilMedUniv） ，2000
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