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1、 纳米流式检测仪应用手册 纳米颗粒的散射检测灵敏度达到前所未有的 24 nm 世界上首台纳米颗粒（100 nm）多参数表征的流式表征设备 覆盖了传统流式细胞仪 200 nm 以下粒径检测的盲区 市场上唯一检测范围可以完全包容细胞外囊泡（30-200 nm）的流式检测仪 Your Research Revolutionized 纳米流式检测仪-纳米生物单颗粒综合表征平台 High Sensitivity Flow Cytometry for Nanoparticle Analysis 荧光灵敏度 （212 nm 荧光二氧化硅微球混合样品） 散射光灵敏度 可媲美电镜的分辨率 （40, 50, 64
2、, 78 and 90 nm 二氧化硅微球混合样品） Unmatched Performance with Superior Sensitivity for Nanoparticles 侧向散射灵敏度 30 nm 侧向散射分辨率 40/50 nm 荧光灵敏度 FITC 10 MESF 荧光分辨率 42/133 AF532 颗粒尺寸 7-500 nm 样品采样速率 10,000 events/min 1 目 录 囊泡 . 2 1.脂质体囊泡的单颗粒水平多参数定量分析 . 2 2.单颗粒水平对细胞外囊泡的多参数表征 . 3 纳米药物 . 5 1.临床抗肿瘤药物阿霉素脂质体的快速表征 . 5 2.临
3、床 II 期核酸纳米药物的表征用于基因沉默的携载 siRNA 的脂质纳米粒 . 6 病毒 . 7 1.病毒的单颗粒水平无标记检测 . 7 2.颗粒材质对于散射光的影响 . 8 3.病毒混合物的粒径分辨 . 9 4.病毒样品的纯度测定和质量控制 . 10 细菌 . 11 1.单个细菌自发荧光的检测与定量 . 11 2.单细菌低拷贝蛋白的高通量测定 . 12 3.基于-内酰胺酶活性的耐药菌快速筛查 13 4.细菌感染及细菌耐药的临床诊断 . 14 5.饮用水、茶饮中细菌总数的检测 . 15 6.致病菌和总菌的绝对定量检测 . 16 线粒体 . 17 1.线粒体纯度和结构完整性的快速表征 . 17
4、2.膜电位检测与靶向线粒体抗癌药物的筛选 . 18 3.单线粒体水平蛋白拷贝数及其分布的测定 . 19 纳米材料 . 20 1.纳米金颗粒的粒径分辨和绝对定量分析 . 20 2 囊泡 1. 脂质体囊泡的单颗粒水平多参数定量分析 实验简介 脂质体是一种微小的囊泡，其组成成分与细胞膜相同。脂 质体纳米药物是目前临床上最受认可的载药系统。这里，纳米 流式检测装置用于快速、同时测定单个脂质体颗粒的散射光和 荧光信号。为了解决脂质体折射率的尺寸依赖性问题，我们合 成并表征了不同粒径的阿霉素脂质体作为粒径校准标准，同时 测量其颗粒粒径和药物包裹量。这个方法为脂质体囊泡的多参 数表征提供了一个高度实用的平台
5、。 仪器与试剂 纳米流式检测装置，选用波长为 532 nm 的激光器，检测通道分别为散射通道和 PE 荧光通道。 实验结果 图 1. 标准阿霉素脂质体的粒径和药物含量表征。 图 2. 包裹阿霉素的脂质体样品的多参数定量分析。 结果分析 1. 纳米流式检测装置的灵敏度高，可以同时测定粒径低至 30 nm 的阿霉素脂质体的散射光和荧光信号。 2. 以自行合成的阿霉素脂质体作为模型，用纳米流式检测装置首次对其颗粒粒径，药物包裹量，药物包封率以及颗粒浓度 进行绝对定量分析。 ACS Appl. Mater. Interfaces, 2017, 9, 13913-13919. 3 2. 单颗粒水平对细胞
6、外囊泡的多参数表征 细胞外囊泡 （extracellular vesicles, EVs） 是一种由细胞释放到细胞外基质的膜性小囊泡， 其粒径分布范围为 30 nm1 m， 它们通过膜上的蛋白质、脂类等信号分子，以及膜内包裹的内容物（神经递质、酶、激素和核酸等）在细胞之间的通讯和机 体调控中发挥着至关重要的作用。根据分泌途径的不同，EVs 主要分为 exosomes（外泌体）和 microvesicles（微囊泡）两 大类。Exosomes 经由细胞内多泡体（multivesicular body, MVB）与细胞膜融合而释放，大小一般为 30120 nm，而 microvesicles (1
7、001000 nm)则是通过细胞膜包裹信号分子而直接释放。研究发现 EVs 广泛存在于人体的血液、乳汁、尿液 以及唾液等体液中， 其种类和数量与机体的生理状态息息相关。 细胞外囊泡有望成为新型的疾病诊断标志物、 纳米药物载体、 以及治疗试剂和药物作用靶标，从而在疾病的诊断和治疗领域具有巨大的应用前景。 细胞外囊泡具有颗粒粒径小，异质性高，折射率低等特点，所以对其进行单颗粒检测极具挑战性。目前细胞外囊泡的检 测方法主要有电子显微镜，纳米颗粒追踪分析技术（nanoparticle tracking analysis, NTA），纳米孔可调电阻脉冲感应技术 （tunable resistive pu
8、lse sensing, TRPS）和流式细胞术等。流式细胞术不仅可以检测囊泡的粒径、浓度，而且通过免疫荧 光标记可以检测囊泡的来源，将囊泡进行分类，通过核酸染色可以检测囊泡内部的 RNA，研究基因表达的调控机理。因此， 流式细胞术是进行囊泡快速、高通量、多参数表征的最优选择。然而，传统流式细胞仪针对的样本主要是细胞，散射光的检 测极限通常是 300-500 nm，而绝大多数细胞外囊泡的直径都在 200 nm 以下，因而传统的流式细胞仪并不适用于检测囊泡颗 粒。纳米流式检测装置为流式检测囊泡开辟了蹊径，利用该设备可以建立细胞外囊泡分析的标准方法。目前有大量数据尚未 发布，如有兴趣请关注网站内容
9、更新 。 图 1. 细胞外囊泡的分泌途径和结构示意图 图 2. 纳米流式检测仪对外泌体的表征策略 仪器与试剂 纳米流式检测装置，脂质和膜蛋白分析选用波长为 532 nm 的激光器，检测通道分别为散射通道和 PE 荧光通道；RNA 分析 选用波长为 488 nm 的激光器，检测通道分别为散射通道和 FITC 荧光通道。 4 实验结果 图 3. 纳米流式检测仪对血浆中提取 EVs 的脂质、膜蛋白和 RNA 的多参数表征 结果分析 1. 纳米流式检测装置的灵敏度可以达到单个外泌体的检测需求。 2. 选用合适的荧光染料，可以在单颗粒水平对外泌体的脂质、膜蛋白和 RNA 进行多参数表征。 Unpubli
10、shed Data. 5 纳米药物 1. 临床抗肿瘤药物阿霉素脂质体的快速表征 实验简介 阿霉素脂质体的粒径分布的表征需要使用冷冻透射电镜和复杂 的三维重构技术，需要 2-3 天。而单个颗粒包裹的阿霉素含量则无法 测量。使用纳米流式检测装置对阿霉素脂质体悬液进行测定，借助粒 径标准球和荧光标准球，仅需 2-3 分钟的时间即实现了阿霉素脂质体 粒径和阿霉素含量（分子数）分布的定量表征，而且可在单颗粒水平 进行粒径和包裹阿霉素含量的相关分析。 仪器与试剂 纳米流式检测装置，选用波长为 532 nm 的激光器，检测通道分别为 散射通道和 PE 荧光通道。 实验结果 图 纳米流式检测仪对临床抗肿瘤药物
11、的快速表征 结果分析 1. 纳米流式检测装置可以测量单个纳米药物 Doxoves 的散射光信号和内部包裹的阿霉素的自发荧光信号。 2. 选用折射率接近的一系列单分散性好、粒径已知的二氧化硅纳米颗粒作为粒径标准，建立颗粒的散射光强度与粒径的标 准工作曲线，即可将阿霉素脂质体的散射光强度分布换算成阿霉素脂质体的粒径分布。 3. 选用一系列具有不同荧光亮度的二氧化硅荧光标准球，建立阿霉素当量与荧光强度的标准工作曲线，结合荧光分光光度 计测定的阿霉素在脂质体中的荧光猝灭率，即可将脂质体的荧光信号转换为阿霉素分子的含量。 ACS Nano, 2014, 8,10998-11006. TEM HSFCM
12、6 2. 临床 II 期核酸纳米药物的表征用于基因沉默的携载 siRNA 的脂质纳米粒 实验简介 携载siRNA的脂质纳米粒是目前临床证实最具潜力的RNA干扰 药物，但是纳米药物的颗粒浓度和装载 siRNA 脂质纳米粒（LNPs） 的比率这两项指标目前尚缺乏有效的表征手段， 由于空白的与装载了 siRNA 的脂质纳米颗粒粒径、 形状和密度均非常类似， 即便采用价格 极其昂贵的冷冻透射电镜 （一个样本的测试费为几百欧元）仍然无法 确认纳米颗粒是否装载了 siRNA。在此，纳米流式检测装置对 II 期 临床试验中用于治疗肝病的纳米药物进行多参数定量表征， 用 SYTO 82 标记内部包裹的 siR
13、NA，即可快速判定纳米药物中 siRNA 的包裹效率。 仪器与试剂 纳米流式检测装置，选用波长为 532 nm 的激光器，检测通道分别为散射通道和 PE 荧光通道。 实验结果 图 1. 纳米流式检测装置对 SYTO 82 染色的两种脂质纳米粒的检测 图 2. 荧光内标法对 siRNA 脂质纳米粒进行浓度测定 结果分析 1. 纳米流式检测装置能够测定单个纳米药物的散射光信号，并通过 SYTO 82 荧光标记快速分辨空的和携载 siRNA 的纳米 药物，从而计算 siRNA 的包裹效率。 2. 利用荧光内标法对携载 siRNA 的脂质纳米粒进行浓度定量分析。 ACS Nano, 2014, 8,
14、10998-11006. 7 病毒 1. 病毒的单颗粒水平无标记检测 实验简介 病毒是自然界中分布最广、个体数量最多的生命形式，同时它也是许多致死性疾病的罪魁祸首。历史上各种传染性病毒 如流感病毒、天花、埃博拉病毒的肆虐给人类带来了巨大的灾难；动物病毒和植物病毒感染造成畜牧业和农业的巨额经济损 失。另一方面，病毒具备良好的生物相容性和稳定性、生长繁殖迅速、容易大规模生产，且可以通过化学或基因工程的方法 进行修饰，使其发挥特定的功能。病毒颗粒的物理化学性质对其功能有直接影响，因而发展快速、灵敏、通用的病毒颗粒表 征方法对病毒技术的开发和推广至关重要。 然而，由于病毒纳米颗粒个体微小（直径主要分布
15、在 20-200 nm），结构简单，传统的流式细胞仪无法检测低于 200 nm 的颗粒，因而并不是检测病毒颗粒的最佳选择，目前尚没有一种技术能在单颗粒水平实现病毒纳米颗粒的无标记、快速、准 确检测。纳米流式检测技术的发展为流式检测病毒颗粒开辟了蹊径。 仪器与试剂 纳米流式检测装置，选用波长为 532 nm 的激光器，检测通道为散射通道。 实验结果 图 纳米流式检测仪对轻小病毒 MS2 的无标记检测 结果分析 本实验中选取的病毒是粒径仅为 27 nm 的轻小病毒 MS2，其结构为正二十面体，遗传物质为单链环状 RNA。对 MS2 病 毒检测的信噪比为 11，表明纳米流式检测仪在辨别 MS2 病毒
16、与背景噪声方面具备非常高的灵敏度，这个灵敏度能够满足自 然界中绝大多数病毒纳米颗粒的检测需求。 Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 10239-10243. 8 2. 颗粒材质对于散射光的影响 实验简介 根据 Mie 散射理论，纳米颗粒的散射截面不仅与颗粒粒径有关，还受到颗粒与周围介质的相对折射率的影响。目前，许 多测定病毒粒径的方法都选用聚苯乙烯微球作为粒径标准。然而聚苯乙烯微球的折射率（1.591.60）高于病毒等生物材料的 折射率（1.401.47），这无疑会造成较大的粒径检测误差。根据病毒的结构组成，可以推测其折射率为1.46，与二氧化硅 的折射率（1.463）相近。选取粒径相似的 T7 噬菌体（头部直径 60 nm）、二氧化硅纳米颗粒（60 nm）和聚苯乙烯微球（63 nm）来检验折射率对散射光强度的影响。 仪器与试剂 纳米流式检测装置，选用波长为 532 nm 的激光器，检测通道为散射通道。 实验结果 图 1. 不同材质相似粒径（60 nm）的纳米颗粒检测结果 结果分
