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1、免疫荧光实验步骤 V b3 e) h: r; _* E9 M3 X r0 Z. S2 1. 直接免疫荧光法测抗原* _4 Q9 A+ c3 Q: w s: N（1）基本原理, R$ X4 ! ( 1 J将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。8 J( W# I4 O& E/ o2 P（2）试剂与仪器5 Y2 ?3 $ T( a* gl 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 P7 W) S
2、7 C; Y f8 |0 ! O- W 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释l8 R7 a; q7 p5 o1 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2l 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制# t3 j8 g! p* W7 X) g$ F 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）l1 D) & |) 5 h0 G C 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）l3 7 b% d# x6 N& A+ A7 g. o/ w: O 荧光显微镜l# l: f X; m+ x! |% Q 玻片架l G8 o2 1 W+ M3 s) _ B 滤纸l
3、% J! b+ F1 F/ | v vl 37温箱等。* r9 U , H) b* 3 W4 q（3）实验步骤0 Y z+ ! O! R9 x2 Y2 X: D 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。6 R, B6 X/ Y5 5 e; P 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。* + R6 J g. g 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。) s5
4、 & L% A$ M( ) 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。) O9 A # N. F 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示： M9 d6 j- . S: 1 n（-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（+）荧光明亮；（+ -+）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“+”以上，而各种对照显示为（）或（-），即可判定为阳性。6 q& % p/ r b* V（4）注意事项% C# U2 v$ M9 $ W& W1)对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓
5、度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。/ 7 e% y3 M P3 n7 z; t2)染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25左右），高于37可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2的低温，延长染色时间。低温染色过夜较3730 min效果好的多。! e* / P; L 4 l5 U4 _3)为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。0 ) D7 i: I% Y$ v% f) u5 W 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.
6、01mol/L，pH7.4的PBS。6 h3 e! V& - q. Z7 K, W 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。$ b4 _2 x- q5 X# L/ W6 / X. k& d 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。/ |( J, g* F8 y; : W( V如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。. Q P! U+ y s: Y4 u4)一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。/ D, i/
7、x o8 Z) G0 N 5 P, : T7 m n d2.间接免疫荧光法测抗体/ 0 N _ H& H$ U( : O% D: u（1）基本原理: t1 _3 i) l5 J染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。1 C) J3 F ?4 H H; V) P（2）试剂与仪器5 ; p9 Y! S9 T/ l 磷酸盐缓冲盐水（
8、PBS）：0.01mol/L，pH7.4! i: Y: t# I+ _7 X2 B 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。l% A( p) : p( 1 , q/ k; T l 荧光标记的抗人球蛋白抗体：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释 。$ # m( o4 8 N) g g0 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）l B3 g8 d6 1 P) F U 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）l- F t( s1 a6 P1 t 荧光显微镜l0 F0 X; h$ k6 i$ N5 : Y8 j: S* s
9、玻片架l! q6 c3 e9 N4 p, j% 8 o 滤纸l- 4 u* B* v 37温箱等。l6 F( x J2 k: i, T3 C, 9 I V, 9 Z% （3）实验步骤, u2 t+ T# R a$ p# Z1)滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。5 G9 C; # 9 k$ S) S, U* B2)滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37保温30min。2 W4 X4 J2 K8 0 |& W9 g6 L& r8 l3)取出玻片，置于玻片架
10、上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗1-2次，然后按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡 。! O0 9 e% f3 t* O. m4)取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。 W9 N. z5 E) 4 / b, b5)将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37保温30min。 G) i% x3 * p+ . c* g* w. 4 u. 6)重复操作3。+ L; t0 A# b: b7)取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。 A/ W: V% I% W. I a7 v8)荧光
11、显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。7 , + l4 g0 H& ) _4 S U: h% L（4）注意事项* W! w0 e1 C$ m% c, r& D1)荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱。. X& p0 p! X+ V# R0 v d7 D2)每次试验时 ，需设置以下三种对照：+ |9 L& B# U: b 阳性对照：阳性血清+荧光标记物9 g/ u. ?. H( F/ A8 J 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; H2 Q* 3 Z: v3 S5 O: u; 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物/ b2 o3 f K: f k8 a7 z3. 已知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。3 x5 k, 2 m- k- M2 C- Q G; l _4. 所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。%
