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1、抗肿瘤药物实验法,在抗肿瘤研究中，人们提出了肿瘤多步骤、DNA突变、细胞凋亡、细胞周期核心机制、细胞周期启动及多条信号转导途径参与等许多理论和学说。 抗肿瘤药的研究随着理论的更新和技术的进步，已从以核酸等为靶点的杀伤型细胞毒药转向对肿瘤新靶点的研究。包括化学预防药、分化诱导剂、凋亡诱导剂、信号传导阻滞剂、血管生成抑制剂、肿瘤耐药逆转剂、生物调节剂以及化放疗保护剂等。 随着新型抗癌药的研究，诞生了许多抗肿瘤药物实验方法。,第1节 肿瘤细胞体外筛选方法,一、抗肿瘤药体外方法 动物模型在抗肿瘤药物的评价中起重要的作用，但动物模型费用高，周期长使其不适合大规模的抗肿瘤药物评价。因此抗肿瘤药初步筛选首先
2、应采用肿瘤细胞体外实验方法，既节约成本又节省时间。,1.MTT法 【基本原理】活细胞线粒体中存在的脱氢酶能够代谢还原黄色的溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑（MTT）为蓝紫色的甲臜；而死细胞此酶消失，MTT不被还原。 用DMSO溶解甲臜后，570nm处酶标仪测定其吸光度（OD值）。 OD值与活细胞数成正比，因此可根据OD值推测出活细胞的数目，了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。,【操作步骤】 （1）0.25%胰酶消化对数生长期细胞，5%10%NBS的RPMI 1640调细胞浓度50000个/ml。96孔板100ul/孔。设溶剂对照，每组3-6平行孔。37，5%CO2、95%
3、空气的培养箱中预培养24h，弃上清。 （2）加药物5个10倍稀释的浓度（溶剂常用的有二甲亚砜和水)，通常为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L。 （3）细胞连续培养2472h，每孔加入10l 5mg/ml的MTT溶液（以无血清培养基配制），继续培养4h。 （4）吸去上清。加入200l DMSO，轻轻振荡以使甲臜完全溶解。570nm处用酶标仪测定OD值。 （5）计算抑制率(%)=（对照OD-药物OD）/对照OD*100%,2.XTT法 【基本原理】XTT 是MTT的衍生物，经过活细胞代谢还原成水溶性的代谢产物，代谢产物的量与活细胞的数目成正比，因此利用酶标仪在检测波长465
4、nm处测定代谢物的OD值可以推测活细胞的数量。数据处理方法同MTT法。,【操作步骤】 （1）细胞接种，药物处理均同MTT方法。 （2）药物处理2472h后，每孔加50l XTT溶液（内含50g XTT，5l 10mmol/L的电子偶联剂 (PMS)）继续培养4h。 （3）96孔培养板振荡23min后，直接用酶标仪在465nm波长处测OD值。,【注意事项】 （1）优点：XTT代谢产物溶解于水，不需要吸去上清就可测OD值，简单方便，减少误差。 （2）XTT不易被线粒体酶还原，因此同时加入电子偶联剂 (PMS)。 （3）每孔的XTT量不宜加入太多，高浓度的代谢产物抑制线粒体酶活性。 （4）XTT和P
5、MS现用现配。,3.染料排斥法检测药物对肿瘤细胞的生长抑制 【基本原理】 活细胞有排斥染料（如伊红、台盼蓝、苯胺黑等染色的能力，而细胞死亡后由于膜完整性遭到破坏，细胞即被着色。,【操作步骤】 （1）25ml培养瓶中加入细胞4104个、受试药40l，终体积4ml， （2）5%CO2，37培养4896h。 （3）取细胞悬液0.4ml，加0.4%台盼蓝液0.1ml，在室温作用5min，在15min内，细胞计数板计数约200个细胞中死细胞（蓝色）的个数。 【结果评定】 （1）活细胞率%=（未染色细胞数/细胞总数）100%。 （2）将活细胞率与药物浓度的对数作图，可得到S形剂量反应曲线，计算半数杀伤浓度
6、（LC50）。 （3）当LC5010g/ml并能重复时，提示药物应进一步实验。,【注意事项】 药物杀伤细胞作用可能被低估原因： （1）存活细胞可能继续繁殖，使活细胞率增高。 （2）死细胞可能过早地崩解，计数时已不存在，使死细胞率下降。,4.集落形成法测定药物对肿瘤克隆原细胞的生长抑制作用 【基本原理】克隆原细胞指具有持续增殖能力的细胞。当单个细胞能连续分裂6代或以上时，其后代所组成的群体（集落）含50个以上细胞。计数集落可以对克隆原细胞作定量分析。反映了单个细胞增殖潜力，能较灵敏地测定抗肿瘤药物的活性，目前被认为是一种较理想的检测方法。 常用的集落形成方法可分为贴壁法及半固体培养基法。,【操作
7、步骤】 （1）贴壁集落形成：适用于几乎所有贴壁生长的细胞。 1）生长期贴壁细胞一瓶，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，活细胞计数，培养基稀释成50100个细胞/ml。 2）取直径3335mm培养皿（或15ml培养瓶）或6孔板，每组3复孔/皿，受试药20l，稀释后细胞悬液2ml，摇匀，5%CO2、37培养箱培养714天。 3）弃上清，PBS洗2次，2ml/次，无水甲醇固定5min，静置干燥，用吉姆萨染色或1%结晶紫染色510min后，用自来水冲洗，室温干燥，镜下计数75m以上的集落。,（2）软琼脂集落形成：适用悬浮和贴壁生长细胞。 1）计数对数生长期细胞，15% NBS培养液配成1000个/ml细胞悬液
8、，37温育。 2）取3335mm培养皿，3复皿，加受试药20l。 3）取37新鲜培养液9份，加沸水浴中融化的5%琼脂液1份，摇匀，加入平皿，每个1ml，混匀置室温使琼脂凝固。 4）取预温的细胞悬液按每9.4ml加5%琼脂液0.6ml的比例混匀，加入已铺底层琼脂的平皿中，每个1ml，置室温使琼脂凝固。 5）将平皿置5%CO2，37孵育箱中培养710天。 6）镜下计数直径大于75m（50个细胞以上）的集落。,【结果评定】 （1）剂量反应曲线：以集落抑制百分率与剂量对数作图，可以得到一条S形曲线并求出药物的半数抑制浓度（IC50）。 （2）亦可计算各加药组集落形成率。,5、癌细胞分化诱导实验 【基本
9、原理】癌症属于细胞分化异常的疾病。恶性肿瘤存在着明显的细胞分化受阻。白血病、黑色素瘤、肝癌、结肠癌、神经母细胞瘤等可在体外被某些化合物诱导分化为正常细胞或近似正常的细胞。这些发现为抗肿瘤药物研究开辟了一条新的途径。因此，癌的分化治疗已成为癌症研究的重要前沿方向之一。,分化指标包括形态学变化、及生化功能变化 。 人早幼粒细胞白血病HL-60细胞的分化诱导实验 HL-60细胞分化为成熟度不同的粒细胞或巨噬细胞 硝基四氮唑蓝（NBT）试验:NBT还原能力应大于50。 形态学变化的观察:成熟粒细胞所占比例越高，说明分化效果越好。 吞噬功能测定:分化诱导剂的吞噬百分率应在50以上。,肝癌Bel 7402
10、细胞分化诱导实验 【基本原理】肝癌Bel 7402细胞甲胎蛋白（AFP）在肝癌中分泌量很高。-GT（半乳糖转移酶）在癌症发生发展过程中活性逐渐上升。白蛋白（ALB）及TAT（酪氨酸转氨酶）在分化良好细胞下降。在体外测定这些蛋白的含量及活性，用以判断肝癌细胞的分化程度。 AFP及ALB测定 ：AFP、ALB放免测定试剂盒说明测定AFP及ALB含量 -GT 、TAT测定：紫外可见分光光度法。,第2节 肿瘤动物模型体内筛选方法,1.诱发肿瘤动物模型实验法 2.自发肿瘤动物模型实验法 3.移植性肿瘤动物模型实验法 4. 转基因动物肿瘤实验法,对诱发肿瘤的评价 诱发性肿瘤的病因与由环境因素所诱致人癌情况
11、相似。癌细胞增殖动力学在两者间亦接近，故动物诱发肿瘤类似人体肿瘤。 但人癌原因十分复杂，诱癌剂不清，肿瘤的病理组织学与动物不同，发生发展与动物诱发肿瘤不完全一致。 诱发肿瘤不仅诱发需时较长，成癌率不高。多数内脏肿瘤不作解剖，难以判断是否已发生肿瘤。发生时间先后、发展速度个体差异大。 加之化学致癌物的来源比较困难，并随着环境保护意识的增强对相关的动物实验室提出了更高的要求和限止，所以本法不宜作一般抗癌药物筛选应用. 对移植性肿瘤有效的药物，可用本法进一步验证其抗癌疗效。,对自发肿瘤总的评价 其肿瘤发生率与瘤细胞动力学特点与人癌近似，生长较移植肿瘤慢，对药物敏感度不高，疗程较长，故便于进行综合化疗
12、的研究； 理论上用带有自发肿瘤模型筛选药物较理想。然而，动物自发肿瘤的病因取决于的遗传特性，与人癌病因区别较大。 很难在限定期间内得到大量生长均匀的带瘤动物，各动物肿瘤之间生长速度差异也较大，给评价带来困难。 此类肿瘤常用于特殊目的试验或作为“二级筛选”模型。,对转基因小鼠肿瘤模型的评价 该模型较好地再现了人类肿瘤发生发展的完整变化，包括机体从正常演变为癌前病变进而发展为恶性肿瘤的全过程，该模型也为相关基因与肿瘤的关系在整体水平研究和基因药物的研发提供了良好的手段。 但肿瘤的发生受到一个或多个基因的协同调控的，与转基因小鼠肿瘤模型不同； 该模型同样存在实验周期长、肿瘤发生时间不齐、繁育能力较低
13、以及成本较高等缺点。,移植性肿瘤实验法,动物移植性肿瘤实验法是最通用的抗肿瘤方法，比自发性、诱发性及转基因动物肿瘤容易造模,成功率高（100），且能同时获得大量生长相对均匀肿瘤。 一般给药7-10天，第8-11天解剖动物。 观察指标：一般状况，体重变化及死亡率，判断药物是否有明显的抑制肿瘤生长的作用，为抗癌药物临床疗效提供有意义的依据。 动物移植性肿瘤是任何体外试验不能代替的。,一种药物未必对各种类型的移植性肿瘤有效，选择某一瘤株供筛选都可能漏筛药物。 动物肿瘤的生物学特点与人类有较大的差距，动物瘤株恶性程度高，生长迅速，对药物的敏感性比人类自发的癌瘤高得多，因此，对动物肿瘤生长有抑制的药物对
14、人癌不一定有效。本法的命中率低。,筛选药物时最好采用三种瘤株，即肉瘤、腹水型肿瘤和白血病株肿瘤。 国内用肉瘤S180、艾氏癌腹水型EAC和L615白血病，目前L615往往以P388或L1210小鼠白血病株取代。 我国对新药在第一轮筛选有效的基础上，推荐人癌异种模型进行第二轮筛选，即人癌进行T细胞免疫缺陷或免疫抑制裸鼠异种移植模型。,1.1动物选择 常用小鼠、大鼠和地鼠。每批实验用同一性别（但乳癌、卵巢癌、宫颈癌等必须用雌性）。 1.2肿瘤移植 (1)一般要求 无菌、低温（消毒不严、瘤块污染常是接种失败的主要原因） 接种部位: 皮下接种(右前肢腋);肌肉接种(大腿肌肉部); 腹水型接种(腹腔)。
15、,(2)瘤块制备：取接种7-10天、生长旺盛且无溃破瘤源。消毒，切开皮肤、瘤生长良好（无坏死或液化），放入无菌平皿，剪成2-3mm3小块。平皿应置于冰上。无菌套管针抽吸或向套管针内塞进一小瘤块。一般应在30min内接种完毕。 (3)瘤细胞悬液的制备：数个瘤块混合，剪成小块，用玻璃组织匀浆器研磨，生理盐水适量稀释成l：3或l：4的瘤细胞悬液。,(4)腹水型肿瘤悬液的制备 1)抽取腹水：选择接种后7-10天瘤源动物，腹水应为乳白色浓稠液体(如黄色或有大量红细胞则弃去)。 2)细胞计数：用白细胞计数法计瘤细胞总数。 3)接种：腹水用无菌生理盐水或含葡萄糖的平衡盐水(如Hanks液、Gey液等)稀释至
16、适当的浓度（1107 /ml ），ip每鼠0.2ml。 (5)白细胞瘤株的接种：腹水型白细胞瘤如P388及L1210的接种同腹水型肿瘤接种法。,1.3 移植性动物肿瘤的质量鉴定 (1)每年进行一次实验动物瘤株的组织学检查。 (2) 接种前置37培养箱内以检查细菌，霉菌;在接种和传代过程中，必须严格无菌操作，防止感染。 (3)肿瘤生长潜力的检查 1)实体瘤：若对照组中20肿瘤400mg或平均重量1g；大鼠肿瘤平均重量小于2g，作废。 2)腹水型肿瘤：对照组平均生存率应在规定范围内。,(4)死亡分析：动物体重减轻、明显的感染等都会影响实验的可靠性，必须追究原因（是否给药剂量过大等）。 (5)阳性对照：通常选用对所选瘤株敏感的已知抗肿瘤药作阳性对照。如S180、EAC皮下型可用环磷酰胺2030mg(kgd)；L615可用5-Fu 25mg/(kgd)。 在同类型化合物抗肿瘤试验时，最好使用同类型临床有效的药物。,1.4 待筛药物的给药途径 化学合成药、抗生素滤液及植物药的提取物，通常用ip、sc或ig给药
