扫描电子显微镜的样品制备技术

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1、第六章 扫描电子显微镜的 样品制备技术,6.1 SEM样品制备的基本要求,SEM对样品基本要求： 基本性质：干净、干燥、导电、不发光、 不发热、磁性弱。 大 小：直径最大不宜超过10 mm，高度在3-5 mm之间，在满足观察的情况下，样品尽量小为宜。,对试样的要求试样可以是块状或粉末颗粒，试样大小要适合仪器专用样品座的尺寸，不能过大。样品座尺寸各仪器不尽相同，一般小的样品座为 3 5mm ，大的样品座为 30 50mm ，以分别用来放置不同大小的试样，样品的高度也有一定的限制，一般在 5 10mm 左右。 表面受到污染的试样，要在不破坏试样表面结构的前提下进行适当清洗，然后干燥。 新断开的断口

2、或断面，一般不需要进行处理，以免破坏断口或表面的结构状态。有些试样的表面、断口需要进行适当的侵蚀，才能暴露某些结构细节，则在侵蚀后应将表面或断口清洗干净，然后烘干。 要求在真空中能保持稳定，含有水分的试样应先干燥除去水分。 对磁性试样要预先去磁，以免观察时电子束受到磁场的影响。 要求导电，不导电的观察前进行导电处理。,块状试样扫描电镜的试样制备是比较简便的。对于块状导电材料，除了大小要适合仪器样品座尺寸外，基本上不需要进行什么制备，用导电胶把试样粘结在样品座上，即可放在扫描电镜中观察。对于块状的非导电或导电性较差的材料，要先进行镀膜处理，在材料表面形成一层导电膜。以避免电荷积累，影响图象质量。

3、并可防止试样的热损伤。,6.1.2块状试样的制备,6.1.3粉体试样的制备,粉体可以直接撒在样品座的双面碳导电胶上，用平的表面物体，例如玻璃板压紧，然后用洗耳球吹去粘结不牢固的颗粒。 对细颗粒的粉体分析时，特别是形貌观察时，将粉体用酒精或水在超声波清洗机内分散，再用滴管把均匀混合的粉体滴在样品座上，待液体烘干或自然干燥后，粉体靠表面吸附力即可粘附在样品座上。,在制备SEM样品时，必须掌握以下原则： (1)每一操作过程，都应注意防止样品的污染和损伤，使被观察的样品尽可能保持原有的外貌和微细结构； (2)去除样品内水份，以利于维持SEM的真空度和防止镜筒的污染。但在脱水和干燥处理时，要尽量减少避免

4、样品体积变小和收缩变形等人工假象； (3)降低样品表面的电阻率，增加样品的导电性能，以提高二次电子发射率，建立适度的反差和减少样品的充放电效应； (4)观察组织细胞的表面或内部微结构，应注意和保护样品的观察面。,6.1.4常规生物样品制备技术,制备过程如下： 取材 根据需要，切取适当大小的样品。专门的SEM备有灵活可动，范围较大的样品台，样品可大些。装在透射电镜上的扫描附件，活动范围较小，样品直径应在34mm左右。 漂洗 用缓冲液把组织表面洗净，否则会影响正常形态，但以快速和轻巧为宜，尽量保护器官或组织的表面结构，使其不致因不慎的操作造成人为损伤。 固定 用2.55戊二醛/缓冲液在室温或4摄氏

5、度下前固定。具体时间可根据样品的需要而定，一般单细胞10-30分钟，较大的或较硬的样品可达1-2h或更长时间。 漂洗 用缓冲液洗3次，洗去未结合的戊二醛。 重固定 1锇酸/缓冲液4摄氏度下后固定1060min。有时为了提高样品的反差和固定效果，可以综合固定液，如随意选用戊二醛、多聚甲醛、锇酸等按照不同的比例混合使用。,漂洗 用缓冲液洗去未结合的锇酸。 脱水 用30、50、70、80、90、95、100、100丙酮或乙醇溶液各10-15分钟，大于1mm的样品可脱水1020分钟。 干燥 一般情况下，可把脱水后的样品放在空气中自然干燥或45热风吹干。有些研究工作要求尽量完好保存样品表面的精细结构，可

6、用真空干燥法、冷冻干燥法和临界点干燥法等使样品干燥。这些方法都比空气干燥法效果好，其中临界点干燥法优点多，多被研究工作者采用。 导电 ：离子溅射、真空镀膜或导电染色处理,6.2.1固定与脱水,样品的固定：为了把生物样品的微细结构和外部形态真实的保留下来，SEM样品必须进行固定处理。通过固定还可以使组织硬化，从而增强样品在干燥过程中耐受表面张力变化发生龟裂，还能提高样品耐受电子束轰击的能力。常用的固定剂为醛类和四氧化锇，还有多聚甲醛和高锰酸钾等。固定的方式有浸泡固定、灌注固定、微波和化学混合固定。 脱水处理：对保证金属镀膜装置和电镜的镜筒真空度和防止样品在高真空状态下的龟裂和变形等有重要的作用。

7、采用不同浓度的乙醇或丙酮梯度脱水逐步的除去样品中的水分。,6.2.2 样品的干燥：,1. 自然干燥法：把样品暴露在空气中直接干燥，只适用于表面比较坚硬或含水分较少的生物样品。如：昆虫、骨骼、牙齿、毛发、种子、果壳、花粉、植物标本，以及微小材料如细菌等。具体做法是：先将样品固定，并系列脱水到100，在大气中让脱水剂自然挥发即可，但注意环境要干燥。因为脱水剂的表面张力系数比水小所以样品在脱水剂中不会过多变形而影响其结构。 2. 真空干燥法：是直接将固定及脱水的样品放入真空镀膜仪内，在低真空状态下使样品内的溶液逐步挥发，当达到高真空时样品即可干燥，随后进行金属镀膜。这一方法简单易行，但是仍存在一定的

8、表面张力问题，固在缺少其它的干燥手段时才选用。,3 临界点干燥：目前最理想的简单的干燥法。临界点干燥仪利用物质在临界状态下液体表面张力逐渐被消除的特性，减少样品干燥过程中的变形和收缩，从而达到样品的完全干燥。 4 冷冻干燥：在此过程中，样品中的水分直接由冰态升华为气态，样品也不受表面张力的影响。但这种方法的不足之处是样品中的水分易形成冰晶而破坏超微结构。,6.2.3 临界点干燥,临界点：在一定的温度和压力下，某物质的液态和气态界面消失，由液态瞬间转化为气态，此时的温度即该物质的临界点温度（C.T），同时也是该物质的临界点（C.P）。而此时的压力和该物质的密度称为临界压力和临界密度。不同的物质有

9、各自的临界点和临界压力。在临界点时表面张力作用消失，分子之间的内聚力等于零。临界点干燥仪的设计就依据了这种物理性质。 干燥剂：考虑到生物样品有限的承受力，一般选择低温和低压临界点的干燥剂.有多种物质可以作为临界点干燥的干燥剂，如：液态二氧化碳、干冰（固体二氧化碳）、氟利昂以及一氧化二氮。最常用的为液态二氧化碳。,常用几种干燥剂的临界值,临界点干燥法原理,在干燥过程中，表面张力会使样品变形。因此，为了保持样品的完好形态，必须消除表面张力造成的影响。我们知道，液体表面张力随其温度的升高而急骤变小。对于每一种液体，都有一个表面张力为零的温度，这个温度叫临界温度。与临界温度对应的压力叫临界压力，在临界

10、温度和临界压力下使样品干燥的方法叫临界点干燥法。现在，国内外都有商品临界点干燥仪。 照理，含水样品可以直接进行临界点干燥。可是，由于水的临界温度高达374，临界压力高达2.4710Pa(218个大气压)，这样高的温度和压力不仅会破坏样品的形态构造，而且需要耐压很高的仪器。解决这个问题的办法就是选择临界温度接近室温，临界压力接近大气压的液体取代样品中的水，然后对这种液体进行临界点干燥，使样品达到干燥的目的。这种液体叫做转移液。对转移液的要求，除要求其适当的临界温度和临界压力外，还应考虑其毒性、密度、成本和溶剂性质等，一般常用液体CO2。,液态CO2临界点干燥法的过程,样品固定后系列乙醇脱水到10

11、0。 中间液替换：因为样品要从脱水剂乙醇经中间液过渡到转移液。因此，中间液既要和脱水剂互溶，又要和转移液互溶。具体步骤是：脱水后的样品在70乙醇与30醋酸异戊酯混合液中浸1020分钟，然后再在30乙醇与70醋酸异戊酯混合液中浸1020分钟，而后用100中间液(醋酸异戊酯)浸两次，每次各1020分钟。 转移液替换：用CO2作转移液替换中间液的过程，是在封闭的耐压室内进行的。用酒精或丙酮清洗临界点干燥器的进气管道和耐压室，吹干后，反复12次放入和排出液体CO2，然后在耐压室底部放数层滤纸，并将装有样品的样品架放入。拧紧耐压室盖，慢慢放入液体CO2。然后稍开排气阀，以5L/min的流量排出耐压室原来

12、的气体，此时可闻到醋酸异戊酯味，待醋酸异戊酯味消失后，关闭排气阀。,此时通过观察窗观察室内液体CO2应浸没样品(如果不能浸没样品，说明耐压室温度高，应降温后再行操作)，关闭进气阀，停放约12小时以完成CO2的置换过程。此时压力约为5.6166.46Pa(5765Kgf/cm2)。 加热：用60温水或自动调温装置将耐压室加温，压力很快增加，使压力维持在1.117Pa(110Kgf/cm2)左右。510分钟，CO2全部汽化，从观察窗可看到其汽化过程是：液面上升界面模糊完全混浊透亮无液体。这时的压力约为9.36Pa (95Kgf/cm2)。 排气：在排气管口放一温水杯，这样既可观察排出的气泡数以控制

13、排气速度，又可避免排气管路产生干冰而造成堵塞。慢慢打开排气阀，使压力缓慢下降，并维持耐压室温度在50左右。排气速度不可太快，否则会损伤样品，一般控制在10泡/秒左右约每分钟45Pa9.8 5Pa(510Kgf/cm2)的降压速度。大约经一个多小时的排气后，压力表指示为“零”，排气口无气泡时，即可打开耐压室，取出已干燥好的样品。,临界点干燥仪,临界点干燥的失误和解决办法,1.样品干燥不充分：这是最常见的问题，可能有以下几种原因： （1）脱水不彻底，中间液醋酸异戊酯和液态二氧化碳置换不良，最终导致干燥不充分。 （2）醋酸异戊酯反流：在冬季反复使用仪器，可能使醋酸异戊酯凝结在排气管上。如果此时打开样

14、品室盖，由于气压的变化，会使排气管中的醋酸异戊酯反流，并浸湿已干燥好的样品。解决的办法是沿样品室的内壁垫上一层滤纸，用来吸附反流的醋酸异戊酯。 （3）一次干燥的样品过多：样品笼的高度一般以不超过样品室深度的一般为宜。否则样品过多，带入的醋酸异戊酯也过多样品不易干燥充分。,2.样品室内压力达不到要求： （1）注入液态二氧化碳量过少：可能会使样品位于二氧化碳的气液面交界处，样品受到液体二氧化碳表面张力的作用，尽管比水的表面张力小的多，但仍会影响样品的精细结构。 （2）样品室密闭不良：这可能是因为垫圈老化，有裂纹，或垫圈下有异物等。 3.注入液体二氧化碳困难：主要因为样品室的温度高，没有事先降温。夏

15、季室温高于30度时更易造成注入困难。降温的办法有两种：一是用少许液体二氧化碳充盈2-3次，再放掉气体的二氧化碳；二是用控温钮调制低于室温10度。,6.2.4 冷冻干燥法,在冷冻干燥过程中，样品中的水分直接由冰态升华为气态，样品也不受表面张力的影响。但这种方法也有不足之处，如：样品中的水分易形成冰晶而破坏超微结构。因此需要大量的冷冻剂和较好的真空装置，使造价提高。再加上所需冷冻时间过长，更限制了这种方法的使用。所以，尽管用这种方法能较好地保存样品中的水溶性和脂溶性 物质，但是使用仍不普遍。有下面两种方法：,一直接冷冻干燥法：这种方法适用于新鲜样品。把样品粘附在小铜片上后快速投入丙烷中进行冷冻固定

16、，丙烷须用液氮预冷。固定好的样品放入真空喷镀仪中，用液氮冷却，保持一定的温度压力连续抽真空若干天，直至样品完全干燥为止。 乙醇冷冻干燥法： 按照常规方法戊二醛固定，乙醇梯度脱水至100%。把样品投入注满液氮的冷冻干燥仪的金属杯中使样品中的乙醇固化。把金属杯放入冷冻干燥仪的喷度装置中，通过旋转泵抽气使液氮固化并升华，接着固化的乙醇也升华，样品随之干燥。,6.3 导电,大多数生物样品的表面电阻很高，直接用扫描电镜观察会产生充放电效应，所以要对样品进行导电处理。常用的导电处理方法有金属喷镀法和导电染色法。 金属喷镀法是将干燥后的样品用导电胶粘在样品台上，放入真空喷镀仪内或离子溅射仪内喷约15nm厚的碳或金，随后进行电镜观察。这种方法除可消除充放电效应外，还可提高二次电子发射率。缺点是热辐射和原子轰击会使样品变形。 导电染色法是用金属盐类化合物与生物体的蛋白质、脂类、糖类等结合，使表面离子化，或游离出金属分子镶嵌于生物分子间，从而使