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1、全国高等医药教材建设研究会 卫生部规划教材 全国高等学校教材 供七、八年制临床医学等专业用 医学分子生物学 Medical Molecular Biology 主编 冯作化 人民卫生出版社 2005年8月第一版 课件制作：吴耀生(版权所有) 广西医科大学基础医学院 生物化学与分子生物学教研室 2008.10,第十三章,基因工程与基因体外表达,Gene Engineering and Gene Expression,目的与意义,1.获得感兴趣的目的基因,2.研究基因结构特征,3.表达基因产物,4.研究基因功能,基本要素,1. 目的基因 (target genes),2. 工具酶 (tool en
2、zymes),3. 载体 (vectors),4. 宿主细胞 (host cells),Main contents,工具酶,DNA载体,基因克隆过程,真核细胞基因转染,基因改造,克隆基因表达,电子克隆,基本概念及背景,For Example,如何从植物中克隆法呢基焦磷酸合酶(FPS)?,1. 查资料认识FPS,2. 设计实验方案,3. 可行性分析,For Example,FPS 克隆： RT-PCR， 3-RACE， 5-RACE,改进的异硫氰酸胍一步法提取三七根部总RNA,RT-PCR扩增fps部分保守序列,3-RACE 及克隆测序,5-RACE 及克隆测序,序列拼接,mRNA: 5 AAA
3、AAA3,TTTTTTT-接头,cDNA:,Oligo dT接头,基因特异性引物,3 Full RACE原理图,5 Full RACE原理图,(1),5-端磷酸化RT-Primer,逆转录,RNA分解,用RNA ligase进行环化或形成首尾连接物,1stand 2nd PCR,5-端磷酸化RT primer部位,包含未知的5上游区域的扩增产物,(2),(3),(4),Thank You,DNA重组 DNA recombination,Some concerned concepts:,DNA重组技术 DNA recombination technique,分子克隆 Molecular clon
4、ing,基因工程 Genetic engineering,克隆 Cloning,三大理论基础,1953年，Watson 和Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制原理，解决了基因的自我复制和传递的过程。,40年代，O.T. Avery等通过肺炎链球菌转化实验发现遗传物质的携带者是DNA而不是蛋白质,50年代末到60年代初，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流向和表达问题。,三大技术发明,DNA分子的体外切割与连接技术 1970年 Smith, Wilcox 流感嗜血杆菌(Haemopbilus influenzae) Hind II 1972
5、年 Boyer EcoR I “GAATTC” 1967年 世界上5个实验室几乎同时发现了DNA ligase 1970年 T4 DNA ligase,大肠杆菌转化体系的建立-复制工厂,基因工程载体的使用：plasmid, phage, viruses,1978年Nobel 医学与生理学奖,The Nobel Prize in Medicine was awarded, in 1978, to Daniel Nathans, Werner Arber, and Hamilton Smith for the discovery of restriction endonucleases. Thei
6、r discovery lead to the development of recombinant DNA technology that allowed, for example, the large scale production of human insulin for diabetics using E. coli bacteria. Over 3000 restriction enzymes have been studied in detail, and more than 600 of these are available commercially and are rout
7、inely used for DNA modification and manipulation in laboratories.,DNA ligase repairing chromosomal damage. ligase I, DNA, ATP-dependent,第一节 基因克隆是利用工具酶进行操作,工具酶(Tool enzymes )-,用于对DNA分子进行定点切割、连接、扩增、 标记等操作的特殊酶类，已被纯化并商品化进 行应用,一、 限制酶 (RE , restriction endonuclease ),二、其他工具酶 (other tool enzymes),一、RE在基因克隆
8、中用于切割DNA,RE (restriction enzyme, restriction endonuclease )-限制性核酸内切酶，限制酶，能识别DNA双链内特异位点并水解磷酸二酯键，产生特定末端的酶,Restriction enzyme Functions: 能识别DNA内部特异位点并且裂解磷酸二酯键 (1) Sorting of restriction enzyme 有三型，但最重要的是II型酶 (2) Naming of RE,细菌属名,细菌种名,细菌菌株,编号,Escherichia coli RY13 I,属Genus, 种-species, 菌株-strain,EcoR I,
9、Two catalytic manganese ions (one from each monomer) are shown as magenta spheres and are adjacent to the cleaved sites in the DNA made by the enzyme (depicted as gaps in the DNA backbone).,Structure of the homodimeric restriction enzyme EcoRI (cyan and green cartoon diagram) bound to double strande
10、d DNA (brown tubes) based on the PDB 1QPS X-ray crystallographic coordinates.,(3) 限制酶的识别和切割位点 Characters: 通常识别46个碱基，少数识别8个 所识别的序列一般为回文结构(palindrome) 在特异位点内切割DNA双链，产生两种末端,粘性末端,平端,5-粘性末端,3-粘性末端,5-CCCGGG-3 3-GGGCCC5,5-CCC GGG-3 3-GGG CCC-5,+,平端切割(blunt end, such as Sma I ),Go to 109,5-GGTGAATTCAGC-3 3-
11、CCACTTAAGTCG5,5-TTGCTGCAGAAG-3 3-AACGACGTCTTC5,5-粘性末端 (EcoR I ),3-粘性末端 ( Pst I ),5-GGTG AATTCAGC-3 3-CCACTTAA GTCG5,+,5-TTGCTGCA GAAG-3 3-AACG ACGTCTTC5,+,(4) 同工异源酶( isoschizomers ) 来源不同，但能识别和切割同一位点的RE 例：Bam H I 不需ATP RE识别序列长度与切点数： 对同一DNA，识别序列短的，切点数多，片段较短；反之则反之,二、基因克隆需要具有不同功能的工具酶,其他工具酶-用于对DNA分子进行多种操
12、作，也叫修饰酶,作用：剪切、补平、连接、化学修饰等,常用： (1) DNA polymerase I，Klenow Fragment (2) Reverse transcriptase (3) T4 DNA ligase (4) Alkaline phosphatase (5) Terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT (6) Taq DNA polymerase So on,(1) DNA polymerase I Activities： 53聚合活性， 53及 35外切活性 Functions： 在生物体内，填补引物切除后留下的空缺，修复 在生物
13、体外，缺口平移制备探针,DNA polymerase I,Klenow fragment (76KD),Another small fragment,枯草杆菌 蛋白酶,Klenow片段,E.coli DNA pol I,53外切酶,53聚合酶,35外切酶,用枯草杆菌蛋白酶裂解全酶,53聚合酶,35外切酶,Klenow fragment 用途：,1) 补齐双链DNA的3-末端 2) 通过补齐3端使3端标记 3) 在cDNA克隆中，第二股链的合成 4) DNA序列分析,常用的reverse transcriptase:,禽类成骨细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶,(2) Reverse trans
14、criptase,用途：合成cDNA，构建cDNA文库,Moloney 小鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶,第二节 基因克隆需要特定的DNA载体,基因克隆为什么需要载体？,载体的类型-克隆载体，表达载体,载体的来源,细菌质粒,噬菌体DNA(DNA, M13 DNA),病毒DNA,人工载体(cosmid)等,DNA载体(vector)-能与DNA片段连接，构建成新的重组DNA分子，并可携带该外源DNA片段进入一定宿主细胞，在宿主中扩增甚至表达，并有遗传标记进行筛选,载体的概念,Cloning vector能够携带感兴趣的外源DNA（target DNA）进入宿主细胞，并将外源DNA在宿主内进行克
15、隆和扩增，而采用的一些DNA分子称为Cloning vector 。,Cloning vector classes,Plasmid DNA (质粒DNA) Phage DNA (噬菌体DNA) Virus DNA (病毒DNA),Expression vector 能使外源基因在宿主中表达的载体,Expression vector: 含表达调控有关的元件,When E coli is used as host cell, plasmid, phage, cosmid, M13 phage can usually be used as vectors,载体的本质是什么？,Vector characters (cloning vector): 能在宿主细胞中自我复制、自我表达 分子相对较小，在宿主细胞中有高拷贝 具有遗传标志 有多个限制性酶单一酶切位点(多克隆位点) 易与宿主DNA相分离,一、常用克隆载体主要来自质粒和病毒,(一)质粒是常用的克隆载体,Examples: pBR322 pUC,Characters: Small molecular weight, high copies More than one genetic mark Mult
