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1、霍乱弧菌的采样与检测,郓城县人民医院检验科 祝令勤,概况,霍乱弧菌（V.cholera）是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一。曾在世界上引起多次（7次）大流行。 主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水，死亡率甚高。属于国际检疫的烈性传染病。,病原学,霍乱弧菌属于弧菌科弧菌属，革兰染色阴性菌体短小，稍弯曲，两端钝圆，长1.52.0m,宽0.30.4m 。 菌体尾端有鞭毛，运动极为活泼，在暗视野显微镜下呈流星样运动，培养温度以37为最适宜，在碱性（PH8.89.0）肉汤或蛋白胨培养基上易于生长。,霍乱弧菌染色图片,革兰染色,鞭毛染色,分群和分型：,根据O抗原的特异性，可将霍乱弧菌
2、分成139个血清群。 根据是否与O1抗血清凝集分两大群， O1群霍乱弧菌：凡能与O1群抗血清发生凝集 非O1群霍乱弧菌：凡不被O1群抗血清凝集的。,O1群霍乱弧菌的生物型,1、古典生物型（前六次大流行） 2、E1 Tor 生物型（第7次 1961年来）。 两个生物型具有相同的血清型。我国流行以El Tor霍乱弧菌为主。,非O1群霍乱弧菌,O139群霍乱弧菌 1992年，在印度印度马德拉斯、泰米尔纳德发生的霍乱疫情，分离到的菌株不与O1群霍乱血清凝集，但是引起O1群霍乱的典型症状。引起WHO重视，定为O139群霍乱弧菌，被认为下一次霍乱大流行主角。,O139的生物学特征：,生化特征与O1菌基本相
3、同。 含有与O1群霍乱弧菌相同毒力基因 除O抗原不同外，其它性状均与EL-Tor生物型相似。 毒力蛋白及其调控因子与El-Tor霍乱具有高度同源的编码。 O139菌可以产生荚膜 与O1群霍乱无交叉免疫力 环境适应能力强 耐药性强,标本采集和送检,1、粪便采集 （1）采样 应在发病早期，服用抗菌药物之前完成，并尽快送到检验室。粪便标本采集方法如下：用棉拭子采取自然排出的新鲜大便，也可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3cm-5cm处采取，水样便采取1ml-3ml，成型便采取指甲大小的粪便量。 病人的呕吐物，沾染粪便的衣服和用具，也可作为检材。,（2）送检 剧烈腹泻病人的水样便含有大量病菌，直接分
4、离培养不难检出阳性。不能立即检查的，要接种于培养基内，尽快送往检验室。送检标本可放入（PH8.6-9.0）碱性蛋白胨水，也可放入文腊二氏保存液或插入Cary-Blair二氏半固体保存培养基中。,2、环境水体：,水体的采样一般要求用灭菌的500ml 水样瓶采集相对静止的30cm 以内）500ml，加盖密封后在室温表层水。取水点的选择应结合流行病学调查等资料确定，同时，采样时应选择在水流平稳或静止处吸取。非疫情状态下的监测采样时间一般在清晨时，此时水体未受人群活动等因素影响。每个采样点中采样位置应相距数米、采集不少于2 瓶做为平行检测。 （20-25）下送实验室检测。,3、水产品,水生动物的采样通
5、常选取活的或新鲜的水生动物为采集对象， 有时也应考虑冰冻的水生动物，以无菌操作采集合适的部位，如鳃部和/或肠内 容物等，置采样瓶（管）或食品采样袋密封，在常温下送检。有条件的采样点可 将水生动物整体采回实验室再进行相关处置。同时，要求以无菌棉签涂抹五只（条）以上的某类水生动物体表、鳃及/或肛门，置碱性蛋白胨水送检，每管碱性蛋白胨水作一份样品看待。,培 养 1,先以碱性蛋白胨水（pH 8.6）作为增菌液； 再用强选择性分离培养基使用庆大霉素培养基或TCBS 培养基或4号培养基； 弱选择性培养基使用碱性琼脂或碱性胆盐。 应注意不同厂商以及不同批号培养基的质量，每批培养基在使用前必须进行质量检测。,
6、培养 2,检样经碱性胨水37，8-12h 增菌后，每份 样品分别接种一个9cm 直径的庆大霉素琼脂或TCBS 琼脂平板和一个碱性琼脂平板进行划线分离培养。 同时，以无菌吸管吸取0.2-0.5ml 增菌液接种到新的碱性蛋白胨水中，进行二次增菌培养后，再如上述步骤进行划线分离培养。 特别强调所有环境样品的增菌分离培养步骤必须包括上述二次增菌和强、弱双平板分离。,鉴 定,TCBS上出现黄色菌落，4号琼脂或庆大霉素平板上出现灰褐色中心的菌落，均为可疑菌落，应使用O1群和O139群霍乱弧菌的多价和单价抗血清进行玻片凝集试验，结合菌落特征和菌体形态，作出初步报告。,疑似菌落鉴定基本要求：,分别从庆大霉素琼
7、脂或TCBS 琼脂、碱性琼脂 平板上各挑取5 个以上的（少于5 个的全部挑取）疑似菌落接种于营养琼脂斜面置3718-24h 纯培养（即每份样品至少从4 个分离平板上获得约20 株可疑菌落菌株），取斜面纯培养物进行O1 群及O139 群霍乱诊断血清玻片凝集试验，血清凝集阳性的菌株继续相关的系统鉴定并报告结果。必须注意同一样品中O1、O139群霍乱弧菌可能同时存在，有必要对所有选出的菌株都进行凝集试验，以免遗漏。,生化鉴定,用于霍乱弧菌的鉴定试验有：霍乱红试验:霍乱弧菌的两种生物型均呈阳性反应，但是，本反应并非霍乱弧菌特有，许多能分解色氨酸和还原硝酸盐的细菌，均能产生阳性反应；糖发酵试验:霍乱弧菌
8、分解葡萄糖、蔗糖、甘露醇产酸不产气，不发酵阿拉伯糖；粘丝试验:弧菌属细菌除副溶血弧菌部分菌株外，均有此反应；O/129敏感试验：参照药敏试验方法进行。将O/129 10g和150g的纸片贴在接种有待测菌的琼脂平板上，35孵育1824h后，纸片周围出现任何大小的抑菌环均为敏感；O1群和非O1群霍乱弧菌均敏感，但已有对O/129耐药的菌株出现；O139群对O/129耐药，用此试验作鉴定时需特别谨慎，需结合其他试验结果加以综合考虑；耐盐试验:霍乱弧菌可在不含氯化钠和含有6氯化钠培养基中生长，氯化钠浓度高于6则不生长。,TCBS 平板培养菌落形态（呈黄色）,检验程序,标本,增菌培养 碱性蛋白胨水,分离培养（TCBS、碱性平板）,生化鉴定分型,血清学鉴定,确诊报告,初步报告,快速诊断,直接涂片 动力、制动试验,O1群霍乱弧菌检测试剂盒（胶体金法）,O139群霍乱弧菌检测试剂盒（胶体金法）,谢谢大家！,
