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1、免疫组织化学基本技术（2）,武汉大学基础医学院病理学教研室 薛敬玲 副教授,免疫组化技术操作并不困难，虽然染色过程包括很多步骤，但只要注意一些主要问题，就能完成一张质量好的免疫组化切片。,内 容,1.染色前需注意的问题 2.染色中需注意的问题 3.如何进行科研设计,免疫组化基本流程,以石蜡组织为例sp法： 取材-固定-脱水-透明-浸蜡 包埋-切片-烤片-染色开始，脱 蜡-入水-修复-阻断内源性过氧 化物酶-正常羊血清封闭-一抗- 二抗-三抗-显色,染色前需注意的问题,染色中应注意的问题,一、脱蜡和水化,免疫组化的脱蜡步骤与常规H&E脱蜡步骤相同，免疫组化实验室中脱蜡需与H&E常规脱蜡分离，以保
2、证脱蜡彻底，否则可能导致染色结果的异常。,二、抗体选择,首先确定一抗种属来源能否适应标本来源（人或动物组织），能否适应标本处理形式（冰冻、石蜡），一抗单克隆抗体（鼠、兔）和多克隆抗体（兔、马、羊等）及二，三抗的配套连接，不同方法连接方式不同（S-P、二步法等），购买商品化抗体应尽量购买原液，质量高，保存时间长，而即用型抗体则现买现用，不可长期保存。,多抗和单抗的比较,均一性，单抗的均一性很强 稳定性，单抗的稳定性较差 特异性，单抗的特异性强 重复性，单抗的重复性好,主要有两大类： 1、多克隆抗体：为针对多个抗原决定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。 2、单克隆抗体：为一个B淋巴细胞
3、分化增殖产 生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异 性强。,抗体的稀释方法,直接测定法 从以上结果分析，可以选择1:2001:400之间的浓度,抗体的最佳稀释度 由于各种抗体效价不同，组织中抗原强弱不一，应根据不同情况作适当的调整，以取得中等阳性稀释度为最佳，因其既适合于抗原性强和含量多的标本，也可用于抗原性弱的标本。,抗体滴片技术 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。 要领：甩净组织周围的水。,抗体滴片图示：,三、抗原修复,常规甲醛固定的石蜡切片标本在固定过程中会形成醛键，导致蛋白交联封闭了组织中的部分抗原决定簇，染色前需进行处理，打开醛键暴露抗原，
4、增加细胞和组织的通透性，以使抗体和抗原最大限度结合，提高免疫组化检测阳性率，达到能真实反映该组织蛋白表达水平或抗原含量。抗原修复有酶消化、微波修复、高压处理等。,1、微波修复,本实验室微波修复应用最多，特点是简单、有效，主要根据微波发射高频能量，组织经微波幅射后，会加速组织内部分子高速运动，抗原可完全被暴露出来，用于浆或部分核抗原，膜抗原不用或短时间应用。在0.01M PH6.0柠檬酸缓冲液微波修复时，温度控制在95-100之间维持10分钟，不足或超过100达不到抗原修复最佳效果。,子宫内膜PR染色，修复良好 子宫内膜PR染色，修复不足,2、酶消化,其作用是以化学的方式使醛键断裂，暴露抗原决定
5、族，增加细胞和组织的通透性，以便抗体与抗原最大限度的结合，增强特异性染色，避免非特异性染色，注意有些抗原显示必须先行消化，有些不需要反而破坏抗原性，使阳性率下降，须消化的组织或细胞抗原，也要视抗原在切片中的封闭程度而定。对某些组织抗原经一种酶消化后，可能结果仍不理想，此时可采用双消化法，消化的时间与固定的时间成反比。,胰蛋白酶，用于胞浆抗原，此酶较温和，浓度及消化时间易控制，常用0.05%0.1%, PH7.8, 37消化2030 或更长，微波37可短时消化。 胃蛋白酶，用于间质抗原，常用0.2% PH2.5左右，消化2030或更长，消化后切片应充分洗涤，否则对组织中抗原会进行缓慢消化，破坏组
6、织结构,3、高压处理,家用压力锅，大小尺寸根据需要而定，1000W电炉，多用于核抗原修复，针对微波修复多阴性，进行高压处理为阳性，如p27、p21WAP1、PR、Ki67效果好。 将1500ml3000ml的柠檬酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热56分钟后），计时12分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟3，下接免疫组化染色步骤。,加热处理后免疫组化的染色敏感度大幅度地提高，其机理推测可能是加热打开了组织抗原因福尔马林固定所引起的
7、抗原决定簇的交联，但机理目前仍然还不是十分清楚。,4.抗原修复液的选择,加热抗原修复缓冲液有多种，如柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）, Tris (pH7-8) , EDTA(pH8.0)等, 目前首选柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），优点是染色背景清晰，适合于大多数抗体,Tris和 EDTA两种修复液对部分抗原修复效果较强，但其染色背景同时加深，如使用不当易造成假阳性结果的判断。,值得注意的是没有一种抗原修复液能适合于所有的抗体，柠檬酸缓冲液（pH6.0）可作为免疫组化常规使用的抗原修复缓冲液，但也不能除外某些抗体适用于EDTA和Tris缓冲修复液，一般抗原比较难于表达的抗体多选择EDTA和Tris
8、缓冲修复液。,四、内源性过氧化物酶的灭活,若采用过氧化物酶的检测系统，必须进行内源性过氧化物酶的封闭处理。 因坏死组织、中性粒细胞及红细胞等均存在丰富的内源性过氧化物酶，其活性稳定、强，能与过氧化氢反应，可使二氨基联苯胺（DAB）还原产生棕色反应物与免疫HRP标记特异性染色相同，称之为假阳性。 故应在染色前将内源酶封闭、消除，常用3%H2O2，浓度适中，过低达不到阻断作用，过高破坏细胞表面抗原，时间控制在1015分钟。,蜕膜组织部分胞核PR阳性，血管内红细胞过氧化物酶显色,坏死组织着色,内源性生物素肾小管,IgG交叉反应常引起非特异性背景着色，因不同种系动物分子结构相似，抗一种动物IgG可与另
9、一种动物IgG交叉反应，如：二抗羊抗鼠或羊抗兔血清可与人组织切片上人IgG结合，呈假阳性，用二抗同种动物正常血清封闭某些非特异性结合位点，（正常血清可提供白蛋白，与组织内非特异蛋白结合，含天然抗体中IgG的FC段与待检标本FC段结合），一般用10%正常血清封闭组织1015分钟。,五、正常血清封闭,抗体与内源性Ig交叉反应：,六、免疫组化技术掌握共同条件,1 免疫组化染色中PH值和离子浓度对最终结果有影响，磷酸缓冲液（PBS）PH值中性及弱碱性条件(PH7.8)及低离子强度0.01-0.02M，有利于免疫复合物形成，而酸性条件及高离子强度有利于分解。通常采用0.01M PH7.2-7.4缓冲液作为反应环境洗涤液。,2.PBS洗涤技术 （1）洗涤的目的 保证离子浓度和PH值。 减少非特异反应（抗体不可靠很纯）,（2）方法：洗三次，每次5分钟。,3、抗体最佳孵育温度及时间（一抗孵育） 湿盒孵育，以防抗体的蒸发和干片。室温25或37孵育451h或更长时间或转4过夜。通过预实验，选择合适稀释度，孵育时间与其成正比。孵育时避免干燥，否则会使抗体活性减低或消失。,胞浆着色 一抗过浓或交叉反应：p63（乳腺）,
