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1、青霉素的制备,（A）、理化性质： 1、溶解性：受pH影响 游离酸：易溶于有机溶剂，难溶于水 盐：易溶于水，几乎不溶于有机溶剂，当有机溶剂中含少量水时，溶解度增大。 2、酸碱性：有机弱酸,3、稳定性：干燥纯净的盐固体稳定；纯有机溶剂溶液稳定；遇酸碱易分解；-内酰胺环易为亲核或亲电试剂作用而打开失活；青霉素的水溶液不稳定。 温度、pH对其稳定性的影响,-,4降解反应,5、聚合反应 氨苄青霉素在水溶液中易形成聚合物，是氨苄青霉素过敏反应的主要过敏原之一。,6、过敏反应 可能为青霉噻唑多肽和青霉噻唑蛋白,（B）、制备工艺,1、菌种 最早的原始菌种是点青霉菌(Penicillium notatum)；
2、现用产黄青霉菌(Pen.chrysogenum) 按菌丝的形态分为丝状菌（黄孢子和绿孢子）和球状菌（绿孢子和白孢子）两种。 国内青霉素生产厂大都采用绿色丝状菌，有的厂家用白孢子球状菌。,2、发酵工艺流程,1）丝状菌发酵工艺流程,大米茄子瓶,2）球状菌培养工艺流程 球状菌菌种 亲米孢子 生产米孢子 种子液 发酵液,（亲米孢子培养） 亲米锥形瓶,25度，6-8d,冷冻管,（生产米孢子培养） 大米茄子瓶,25度，8-10d,种子罐培养 种子罐,28度，50-60h，1.5v/(v*min),发酵罐培养 发酵罐,26度，PH6.7-7.0，6-7d，0.8-1.0v/(v*min),3、发酵工艺要点,
3、1）丝状菌：种子：砂土孢子接入斜面上，25培养67天，制成悬液，接入大米茄子瓶内，经25培养67天，制成大米孢子，真空干燥。 生产时按接种量移入种子罐（葡萄糖、玉米浆、尿素），25培养4045小时，菌丝浓度达40%以上，按10%-15%接种量移入繁殖罐（花生饼粉、葡萄糖）内。 经25培养1315小时，菌丝体积40%以上，残糖在1.0%左右，无菌检查合格便可作为种子，按30%接种量移入发酵罐。,2）球状菌：首先由冷冻管孢子接入混合有0.5-1.0%玉米浆的摇瓶培养原始亲米孢子，再接入大米茄子瓶生产大米孢子，两者都是在25度下静置培养10天可收获。保存在5度冰箱。种子培养：冷藏10天以内的生产米，
4、接入种子罐（花生饼粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、饴糖）28度培养50-60h，当PH降为5.5-5.0，菌丝呈菊花团状，平均直径在100-130微米，每毫升球菌数6万-8万只，沉降率在85%以上，可用。接入发酵罐。,培养基,碳源： 提供能量 如乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、天然油脂等。乳糖能被产生菌缓慢利用而维持青霉素分泌的有利条件，故为最佳碳源，但价格高，普遍使用有困难。天然油脂如玉米油、豆油也能被缓慢利用作为有效的碳源，但不可能大规模使用。目前生产上用的碳源是葡萄糖母液和工业用葡萄糖。 丝状菌补糖一般在残糖降至0.6%左右、PH上升后开始加，0.07-0.15%/次，次/h;球状菌在PH高于6.5时
5、开始加糖。,氮源： 提供蛋白合成原料 玉米浆。现因国内玉米浆产量少，经调整配方以花生饼粉代替，生产水平也可达到技术指标。目前生产上用的氮源是花生饼粉、麸质粉玉米胚芽粉及尿素等。,前体 作为苄青霉素生物合成的前体有苯乙酸、苯乙酰胺等。它们一部分能直接结合到青霉素分子中。这些前体对青霉菌都有一定的毒性，加入量不能大于0.1%。加入硫代硫酸钠能减少它们的毒性。,无机盐 硫和磷:硫浓度降低时青霉素产量减少3倍，磷浓度降低时青霉素产量减少1倍。 钙、镁和钾： 青霉素的生物合成中合适的阳离子比例以钾30%、钙20%、镁41%为宜。如镁离子少，钾离子多时，菌丝细胞将培养基中氮源转化成各种氨基酸的能力强。钙离
6、子影响细胞的生长和培养基的pH 。 铁离子：铁易渗入菌丝内，它对青霉素发酵有毒害作用。发酵液中铁含量6微克/毫升时无影响；60微克/毫升时降低产量30%；300微克/毫升时降低产量90%。要低于30微克/ml,培养条件控制,产黄青霉菌分三个不同代谢时期。 菌丝生长繁殖期:发芽、菌丝增殖、形成脂粒、积累藏物。 青霉素分泌期: 菌丝生长趋势减弱，间隙添加葡萄糖作碳源和间隙加入花生饼粉、尿素作氮源，并间隙加入前体，此期间球状菌pH要求6.66.9，丝状菌pH要求6.26.4， 青霉素分泌旺盛。 菌丝自溶期:,控制要点： 1）加糖控制：一般残糖降至0.6%左右、pH上升后可开始加糖。 2）补料及添加前
7、体：丝状菌发酵于接种后812小时，发酵液中残余苯乙酰胺浓度为0.050.08%。球状菌在发酵10h后加入尿素、氨水和苯乙酸的混合料，每3h加入一次，加入量视生长状况。 3）pH控制：主要通过加葡萄糖控制pH，在PH大于6.5时可以加入硫酸铵 4）温度控制：青霉菌生长最适温度（27度）高于青霉素分泌的最适温度（20度）。种子罐培养丝状和球状菌菌要求25，发酵罐培养丝状菌要求26-24-23-22、球状菌要求26-25-24，前期罐温高于后期。,5）通气与搅拌 深层培养需通入一定量空气，并不停地搅拌以保证溶氧的浓度。试验证明，通气量0.8-1.0v/v*min.中、后期减慢转速对球状菌的生理生化代
8、谢有利，它能提高发酵单位，并能节约能源。 6）泡沫与消沫 用化学合成消沫剂“泡敌”等,4、提炼工艺流程,工业钾盐生产工艺流程,p581,1.工业钾盐生产工艺流程,发酵液 一次滤液和其余发酵液 二次滤液 一次丁酯萃取液 缓冲液萃取液 二次丁酯萃取液 脱色脱水液 结晶液 青霉素钾湿结晶体 洗涤后湿晶体 过筛颗粒 干燥粉末 青霉素钾成品,（鼓式真空过滤） 1/3-1/2发酵液,10度以下,（板框过滤） 10%硫酸，0.07%PPB,0.7%硅藻土，28%水,PH4.5-5.0，10度以下,（一次丁酯萃取） 10%硫酸，1/3体积醋酸丁酯，0.1%PPB,PH1.8-2.2，10度以下,（缓冲液萃取）
9、 1.6%碳酸氢钠,PH6.8-7.4，10度以下,二次丁酯萃取，硫酸，丁酯 PH1.8-2.2，10度以下,脱色脱水过滤 活性炭,-10度以下,无菌过滤,结晶，过滤 醋酸钾乙醇溶液,10-20度,洗涤 丁醇，醋酸乙酯,过筛，制粒,真空干燥 90-95度，20mmHg,8-10h,凉粉 40度左右,2.青霉素钠盐制备（共沸蒸馏结晶）,发酵液 二次丁酯萃取液 脱色二次丁酯萃取液 青霉素钠盐水萃取液 结晶液 青霉素钠盐湿结晶 洗后湿结晶 干燥粉末 青霉素钠盐成品,过滤，一次丁酯萃取，缓冲液萃取，二次丁酯萃取,与制青霉素钾盐相同,脱色过滤 活性炭,水萃取， 0.5molNaOH溶液，10度以下,共沸
10、蒸馏 2.5倍体积丁醇,PH6.4-6.8，16-26度，5-10mmHg,过滤,洗涤分离 丁醇，乙酸乙酯,真空干燥 90-95度，10mmHg,8-10h,凉粉 40度左右,5、提炼工艺要点,1）发酵液预处理和过滤 放罐后，首先要冷却 目前采用鼓式过滤及板框过滤，加助滤剂。酸化时pH应控制得高些(pH45)，再加些絮凝剂如十五烷基溴代吡啶(PPB)等, 过滤。 随着高效高速萃取离心机的出现，如德国Westfalia公司出品的倾析器(decantor) ，可革去过滤工序，比用板框过滤除去菌丝后再提取的收率高出23%。,2）影响青霉素提取的主要因素 青霉素提取效果除了已选定适当的有机溶媒，破乳化
11、剂和离心分离设备外，还与下列主要因素有关: pH值 一般从滤液萃取到醋酸丁酯时，pH选择2.02.5，而从丁酯反萃取到水相时，pH选择6.87.2之间。 温度 要求提取在低温(10以下)条件下进行较为有利。在设备上要考虑用冷盐水进行冷却，以降低温度，特别是酸化岗位，温度要求更低些。,时间 酸化时速度应快些。碱化时速度可放慢些，因青霉素在中性下半衰期要长些，破坏要缓和些，故以能分离得清为原则。 萃取方式和浓缩比 萃取剂和萃取方式选择 目前生产上采用二级逆流萃取方式。浓缩比的选择也很重要，因为丁酯的用量与收率和质量都有关系。丁酯用量为滤液体积的2530% 时，色素相对含量低，浓缩比为1.52.5倍。,3）精制 脱色脱水：活性碳脱色；冰冻脱水法，用冷盐水降温至-18- -20度，水结冰析出。 青霉素钾盐结晶：青霉素丁酯二次提取液中，加入醋酸钾乙醇溶液，青霉素钾盐结晶析出。 青霉素钠盐：A、从二次丁酯萃取液中直接结晶，加入醋酸钠乙醇溶液。,B、共沸蒸馏结晶：0.5mol/L浓度的NaOH溶液、在PH6.4-6.8下萃取，得到青霉素钠的水萃取液，浓度为15*104-25*104U/ml。然后加入2.5倍体积的丁醇，在16-26度、5-10mmHg下蒸馏，当浓缩到原来水萃取液体积时，停止蒸馏，有钠盐析出。,
