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1、培养基灭菌 空气除菌,第一节 培养基灭菌,灭菌的概念 灭菌的方法 湿热灭菌的原理 分批灭菌设计 连续灭菌设计 微生物的热死动力学,灭菌的概念,消毒（disinfection）与灭菌（sterilization） 的区别？,杀灭所有微生物,杀灭病源微生物,灭菌的概念,消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。 例如，巴氏消毒法，是将物料加热至60维持30min，以杀死不耐高温的微生物营养细胞。 灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。 消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。,高温瞬间
2、巴氏消毒法的操作流程图,法国微生物学家、化学家、近代微生物学的奠基人。,灭菌的概念,防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。 （1）低温 （4）高渗 （2）缺氧 （5）高酸度 （3）干燥 （6）防腐剂,防腐（antisepsis）,灭菌的方法,化学药物灭菌 射线灭菌 空气的过滤除菌 加热灭菌,化学灭菌法,甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒,射线灭菌,电磁波、紫外线或放射性物质 适用范围：无菌室、接种箱,微波辐射灭菌,紫外线 波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用。作用于DNA，使一条DNA链上相邻的两个胸腺
3、嘧 啶共价结合形成二聚体，导致细菌变异和死亡。 电离辐射 高速电子、X射线、射线 微波 波长1mm1m,过滤除菌法,利用过滤方法阻留微生物 适用范围：制备无菌空气,固定滤膜装置,加热灭菌法,湿热灭菌法 (高压蒸汽) 利用饱和蒸汽灭菌，条件：121，30min 适用范围：生产设备及培养基灭菌 干热灭菌法 常用烘箱，灭菌条件：160下保温1h 适用范围：金属或玻璃器皿 火焰灭菌法 火焰 适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口,湿热灭菌,湿热灭菌原理：蒸汽具有很强的穿透能力，在冷凝时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。 灭菌条件： 121，30min 灭菌不利方面：同时会破坏培养基中
4、的营养成分，甚至产生不利于菌体生长的物质。,关于灭菌和消毒的不正确的理解是（ ） A灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细 胞、芽孢和孢子 B消毒和灭菌实质上是相同的 C接种环用灼烧法灭菌 D常用灭菌的方法有加热法、过滤法、紫外 线法、化学药品法,谷氨酸棒状杆菌的培养液常采用的灭菌方法是（ ） A高压蒸汽灭菌 B高温灭菌 C加入抗生素灭菌 D酒精灭菌,分批灭菌（间歇灭菌）,将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，也称实罐灭菌。,过程包括： 升温、保温和冷却三阶段。 各阶段对灭菌的贡献： 20%、75%、5%。,连续灭菌,将培养基在发酵罐外通过连
5、续灭菌装置进行加热、保温和冷却而进行灭菌。,问题,连续灭菌的基本设备有哪些 ？,连续灭菌,（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到6070 ，以免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声； （2）连消塔，用高温蒸汽使料液温度很快升高到灭菌温度（126132 ）；,连续灭菌,（3）维持罐，使料液在灭菌温度下保持57min。因为：连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的； （4）冷却管，使料液冷却到4050后（冷水喷淋） ，输送到预先灭菌过的罐内。,连续灭菌,连续灭菌,连续灭菌,连续灭菌过程中温度的变化(虚线),间歇灭菌与连续灭菌的比较,微生物的热死动力学,微生物受热死亡的主要原
6、因是高热能使蛋白质变性，这种反应可认为是单分子反应，死亡速率可视为一级反应，即与残存的微生物数量成正比。,微生物的热死动力学,式中 N经时间t后残存的活菌浓度（个/L)， N0开始灭菌时原有活菌浓度（个/L)； t灭菌时间（s, min） K比热死速率常数、灭菌速率常数或比死亡速率常数（s-1,min-1）它的大小与微生物的种类和加热温度有关。在同等温度下，其值小，微生物的耐热性强。 从上式得出：t与N之间的关系为对数,式中N/N0, 菌体存活率，而N0/N，为灭菌度。,微生物的热死动力学,实验证明，细菌孢子的热死灭动力学与营养体细胞显著不同。 对于耐热性的微生物芽孢， 存在“菌体循序死亡模型
7、”假说，认为：芽孢的死亡是渐进的。有耐热的芽孢（R型）转变为死亡的芽孢（D型），需经过敏感的中间过程（S型）。,当温度超过120时，热阻极强的芽孢与营养体的热死灭动力学基本符合一级反应动力学规律。,微生物的热死动力学,T对K的影响,式中：A频率因子，7.941038，min-1 E活化能，J/mol R通用气体常数，8.28J/（molK）,在相同条件下， E越高，K值越低，热死速率越慢。 不同菌的孢子的热死灭反应E各不相同，且K值取决于E和T。 对上式取对数，得,微生物的热死动力学,K是E和T的函数,反应的E越高，lnK对T的变化率越高，即T的变化对K的影响越大。,迅速提高灭菌温度，可加快细
8、菌孢子的死灭速度，缩短在高温下的灭菌时间，而灭菌对于培养基中有效成分的破坏大为减少。,高温短时间灭菌灭菌动力学得出的最重要结论,例1：当杀菌温度从120升至150 ，试计算维生素B1的分解速率常数KB和嗜热脂肪芽孢杆菌的死亡速率常数KS。已知ES=283460 J/mol, As=1.061036 (min-1) ；EB=92114 J/mol, AB=1.061010 (min-1) 解：由（1）式，即K= A (E /RT)得 lnKs= ln As ES /(RT) Ks在120 时为0.0156 (min-1) 150 时为7.54 (min-1)灭菌速率常数提高482倍。 同样地：
9、KB在120 时为0.00535 (min-1)，150 时为0.040 (min-1)，同样的温度变化仅提高6.5倍。,例2：将10000千克的培养基在发酵罐内进行分批灭菌，灭菌温度为120，灭菌后要求每1000批中只有一个杂菌，培养基原始污染度为105个/g，试计算总杀菌效率V总。 解：N=10-3,即，V总=34.5,例3 ：发酵培养基60m3，杂菌活孢子浓度105/mL，要求灭菌后残存孢子数 N为10-3个。设计的T-t过程如下，是否达到灭菌要求？（A=7.941038 min-1，E=287441 J/mol，R=8.28 J/(molK)）,解： 由,可得各个 K值,根据题意，灭菌
10、要求即为，,从得出的K 值可以看出，在100以下灭菌，对细菌孢子的杀灭几乎是无效的，因为从灭菌开始的前36min和63min以后，K值几乎可以忽略不计。在整个灭菌过程只有30min是有效的。,-K-t图， -T-t图,将有效灭菌时间，即34min至64min的图解积分值为33.8,-K-t图， -T-t图,由图可得，T-t的关系为，T=-2.5357t2+39.429t-36.593,因此，,T-t的趋势线,故，设计的T-t过程不能达到灭菌要求。,1.杀灭芽胞最常用和最有效的方法是：_。 a.紫外线照射 b.煮沸5min c.巴氏消毒法 d.高压蒸气灭菌法 2.下述不可能杀灭细菌芽胞的方法是：
11、 _。 a.煮沸法 b.巴氏消毒法 c.间歇灭菌法 d.干热灭菌法 e.高压蒸气灭菌法 3.常用于空气或物体表面的消毒_。 a.高压蒸气灭菌法 b.紫外线照射法 c.滤过除菌法 d.巴氏消毒法 4.常用于基础培养基灭菌_。 a.高压蒸气灭菌法 b.紫外线照射法 c.滤过除菌法 d.巴氏消毒法,第二节 空气除菌,空气除菌的引入 空气中的微生物 空气除菌方法 空气过滤设计 膜过滤器 空气除菌典型流程,空气除菌的引入,微生物发酵分好氧发酵和厌氧发酵两类。 无菌空气是好氧微生物的氧源。 空气过滤失败占发酵染菌各种因素的20%左右。 空气过滤器的作用是防止空气把杂菌带入发酵过程，保证发酵从接种到放罐的整
12、个过程为纯种培养，不受外源微生物的污染。,空气除菌的引入,在普通城市郊区，在干燥、晴朗的天气条件下，空气中微生物数目为102104个/m3 ； 好氧发酵的平均通气量为0.8vvm（每分钟每体积发酵液需要空气体积）； 次级代谢产品的发酵需要200h； 一个100m3的发酵罐； 在整个发酵过程中所需通入空气中的微生物的量为1亿100亿个。,空气中的微生物,空气中悬浮着大量的微生物，它们附着在空气中的灰尘及颗粒或水珠上。 这些微生物包括霉菌、细菌、放线菌、酵母及噬菌体等。 城市空气中微生物的密度较高，农村和山区较低，夏季比冬季多，气候温和潮湿的地区，空气中微生物比较多，工厂附近以主风向上游密度较低。
13、,高度每升高2.5m，空气中的尘埃粒子含量下降一个数量级，因此高空取气很重要。,空气除菌方法,无菌空气是指自然界的空气通过除菌处理使其含量降低到一个极限百分数的净化空气。,获取方法,利用加热、化学药剂或射线：蛋白质变性,利用过滤介质及静电除尘捕集空气中的灰尘及颗粒,空气除菌方法,加热灭菌,原理：微生物在高温下容易被杀死； 利用空气被压缩时产生的热来灭菌。 特点：空气传热效率低，温度分布不均匀， 灭菌时间长； 不适合大量制造无菌空气。,空气除菌方法,辐射灭菌,原理：波长在226.5328.7nm的紫外线对空气中微生物的杀菌效力最强。 声波、高能阴极射线及射线都可用于空气灭菌。 特点：灭菌时间长；
14、 大规模应用不经济； 该法用于无菌室、接种间。,空气除菌方法,化学灭菌,常用的空气灭菌用化学药剂有苯酚、环氧乙烷、过氧化氢、重金属盐、新洁尔灭、甲醛溶液和硫磺等。 原理：将杀菌剂溶于水配成合适的浓度，使空气在杀菌剂溶剂中通过或喷洒于空气中以杀死空气中的微生物。 特点：除菌结束后必须除去夹带杀菌剂的水汽和雾。 应用于无菌室、接种间和培养间的灭菌。,空气除菌方法,静电除尘,原理：使空气中的灰尘成为载电体，然后将其捕集在电极上。 热点：能量消耗少 设备庞大 空气最好为无油，湿度低,空气除菌方法,介质过滤,发酵工业用于发酵罐制备无菌空气的方法是介质过滤。 使用的过滤介质有棉花、玻璃纤维、不锈钢纤维、聚
15、丙烯纤维。 目前在发酵工业上普遍采用的是膜过滤器。,空气过滤设计,采用概率论进行分析空气过滤，基本假设有三点： 纤维填充的空气过滤器由多层介质组成； 微生物经过每一层玻璃纤维时，与玻璃纤维碰撞存在一定概率； 当微生物与纤维碰撞次数小于一定值时，仍能通过过滤器中流出而返回空气中。,滤层厚度越大，空气通过过滤介质的时间越长，捕集效率也就越大； 纤维直径越小，捕集效率也越大。,捕集效率,空气过滤设计,空气过滤器除菌机制,直接截留 惯性冲击 布朗运动或扩散拦截 重力沉降 静电吸引,空气过滤设计,空气过滤器除菌机制,直接截留 空气流线中所夹带的微粒由于和纤维相 接触而被捕集时称为直接截留。 过滤介质起筛
16、网的作用机械截留颗粒。 直接截留的截留效率完全决定于颗粒直径。,空气过滤设计,空气过滤器除菌机制,2. 惯性冲击 颗粒以一定速度向纤维垂直运动时，空气受阻改变流向，绕过纤维前进，微粒因惯性作用不能及时改变方向，便冲向纤维表面并滞留下来。 在较低流速范围内，冲击过滤效率随气流速度增加而降低； 增至临界流速时，效率随气流速度增加而提高； 当气流速度再上升，效率会显著下降。,空气过滤设计,空气过滤器除菌机制,3. 布朗运动或扩散拦截 微小的颗粒受空气分子碰撞发生布朗运动。 颗粒与介质相碰而被捕集成为扩散。 纤维直径越小，气流运动速度越小，扩散捕集效率越高。,空气过滤设计,对数穿透定律,设N1为过滤前空气中的
