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1、HBV DNA定量和变异检测的临床应用,李继刚 2012.02,徐州市第六人民医院,目录,HBV病毒介绍 HBV DNA定量检测的临床意义 HBV DNA定量检测的方法 HBV DNA分型的临床意义 YMDD检测的应用,一、HBV病毒介绍,1.流行状况 乙型肝炎病毒严重威胁着世界人民的身体健康，我国属于高发地区，据卫生部统计，乙肝病毒携带者占10%，20006000万人患有乙型肝炎，每年有28万人死于乙型肝炎病毒感染。,图1.HBV世界流行分布图,图2.2006年统计乙肝病毒携带者分布范围,注： 1.低流行地区：北美、北欧和英国等； 2.中流行区：南欧、西南亚、俄罗斯等； 3.高流行区：,2.
2、乙肝病毒生物学特性,图3.乙肝病毒电镜图：A和C球形，B杆状,外壳：前S1抗原，S1抗原，S2抗原等； 核心：基因组，核心蛋白，DNA聚合酶等；,图4.乙肝病毒模式图,HBV DNA负链有四个开放区，分别称为S、C、P及X(图26-2)，能编码全部已知的HBV蛋白质。S区可分为二部分，S基因和前S基因。S基因(核苷酸155833)能编码主要表面蛋白。S基因之前是一个能编码163个氨基酸(2，848-154)的前S基因，编码Pre S1和Pre S2蛋白。C区基因包括前C基因和C基因，分别编码HBeAg和HBcAg。P区最长，约占基因组75%以上，编码病毒体DNA多聚酶。X区(核苷酸1，3741
3、，835)可能编码有154个氨基酸的碱性多肽，长链的裂口位于此区。,图5.HBV DNA模式图,3.传染源:各种类型的乙肝患者和HBsAg携带者.潜伏期为6周至6个月，平均为3个月. 4.传播途径:由于HBV存在于血液，唾液、泪液、腹水、羊水、尿、精液、阴道分泌物、月经血和乳汁等中，所以传播途径多样且复杂.但主要经血液、母婴和接触传播.,1.高度敏感，可以将HBV的窗口期由60天缩短到49天。从理论上来说，每毫升血清只要有一个病毒就可以检出。 2.基因突变可以导致传统免疫学检测阴性，而基因检测可以避开突变区域，根据其高度保守区设计引物，使其检测结果不受突变影响。例如前核心区域的突变可以引入终止
4、密码子，使,二、HBVDNA 定量检测的临床意义,HBeAg的合成提前终止，但新的病毒仍能合成，肝损伤仍在继续。 3.对肝移植的意义 肝脏移植是目前治疗肝硬化晚期的唯一方法，但是85%以上的既往HBV携带者在因肝移植免疫损伤后重新出现，。HBV DNA检测对肝移植的跟踪监测具有重要意义。 4.监测母婴传播 联合应用高效价免疫球蛋白和乙肝疫苗可以有效阻断母婴传播，但仍有些婴儿不敏感，监测婴儿血中的HBV DNA可以对此进行监测，分析阻断失败的原因。 5.检测药物疗效,1.Real time PCR （1）原理 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性
5、的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。,三、HBV DNA定量检测的方法,图6.实时定量PCR反应曲线,由于荧光值突破背景到达阈值所经历的循环数与模板初始拷贝数成正比，可以根据此原理绘制标准曲线。 根据待测样本管荧光值到达阈值经历的循环数，可以确定样品中该基因的初始模板量。,图7.实时定量PCR标准曲线,（2）常用的荧光物质 a.Sybgreen 该染料嵌合到DNA双链中后，经过激
6、发光激发后发出荧光，荧光强度与PCR产物量成正比。,图8. Sybgreen发光原理,优缺点 优点 a.价格便宜; b.可以做融解曲线分析。 缺点 a.特异性不够好； b.染料对PCR扩增有一定的抑制作用； c.对技术人员的理论水平有较高的要求。,b.Taqman 探针 TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5末端，而淬灭剂则在 3末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭
7、剂分离。 TaqMan 探针适合于各种耐热的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（ MJ Research 公司有售）。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。,探针序列与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5 末端，而淬灭剂则在 3 末端。,当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3 端的淬灭剂接近而被淬灭。,但在进行延伸反应时，聚合酶的 5 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。,发光,图9. Taqman 探针发光原理,图10. Taqman 探针发光原理,优点 a
8、.特异性高于DNA染料法，因为探针序列要与目的序列互 补； b.扩增后的分析对实验人员的理论要求低于DNA染料法。 缺点 a.无法进行融解曲线的分析； b.设计成本较高，价格昂贵。,分子信标（molecular beacon） light upon extention primers(LUX primers) 2.连接酶链反应（LCR）,四、HBV 基因分型,1.分型原理 全基因组序列差异=8%或S区DNA序列差异=4%定义为一个基因型，目前发现HBV存在A、B、C、D、E、F、G、H8个基因型。,2.分型方法 （1）全基因组测序 优点：准确 缺点:耗时耗力，昂贵,需要测序仪 （2）限制性片段
9、多态性分析（RFLP） 优点:特异性高 缺点:耗时，多用于科研 （3）PCR-ELISA 生物素包被微孔，将亲和素标记的探针固定在膜上，使用生物素或地高辛标记的引物扩增目标片段，扩增产物带有标记物，产物与探针结合。相继加入抗生物素或地高辛抗体，以后同ELISA。,优点：比PCR敏感几十倍，且 可以使用不同的探针进行分型，已经有商品化试剂盒 缺点:微量的污染即可导致假阳性且需进行PCR和ELISA两步操作。 (4)反向斑点杂交 原理基本同PCR-ELISA，不同的是将探针固定在同一张膜上，操作方便，所需PCR产物的体积小，已经开始在临床上广泛应用。 （5）Real-time PCR 是目前最流行
10、最简便的方法。原理是根据不同的突变位点设计多对引物和探针，平行扩增，实时定量检测。 优点:定量，方便 缺点：需要多个反应体系,2.临床意义 （1）不同的基因型对药物的敏感性不同， A型对普通干扰素更敏感，长效干扰素对各型的作用基本相同。 （2）临床表现及预后不同。C型多为急性或重型肝炎，预后差 （3）地区差异，我国各型均有，北方以C型为多，南方多为B型，藏族地区以D型为主 （4) 基因的变异可以导致HBsAg和HBeAg阴性,五.YMDD检测的临床应用,1.定义 HBV P区编码的DNA聚合酶基因在739或741位点发生突变，其编码的HBV逆转录酶活性部位“酪氨酸（Y）蛋氨酸（M）天门冬氨酸（
11、D）天门冬氨酸（D）”(YMDD主型区)，变为“酪氨酸（Y）缬氨酸（V）天门冬氨酸（D）天门冬氨酸（D）”（YVDD）或“酪氨酸（Y）异亮氨酸（I）天门冬氨酸（D）天门冬氨酸（D）”（YVDD）导致逆转录酶亚结构发生改变，妨碍了与拉米夫定的结合，从而造成HBV对拉米夫定敏感性下降。,Val-GTG YVDD Ile-ATT ATC YIDD ATA,Met-ATG YMDD,图12. YMDD变异原理,图13. Lamivudine 作用位点,Nucleotides,ss (-) DNA,(variant),Y,V/I,D,D,reduced affinity,图14. Lamivudine
12、耐药机制,拉米夫定治疗HBV感染治疗过程与YMDD变异关系,引自J Virol. Metods 1999；83：181-187,2.YMDD变异检测对用药的指导意义 Lamifudine对HBV YMDD野生型的抗病毒作用优于Adefovir，而且对机体潜在副作用也小于Adefovir，所以针对携带HBV YMDD野生型患者，首选择Lamifudine。 在Lamifudine治疗过程中动态监测YMDD变异情况，一旦出现YMDD变异，改用Adefovir，这样可以持续抑制病毒变异株，第一时间就使病毒变异株就处在抑制状态。 在使用Adefovir药物治疗过程，也动态检测YMDD变异情况，防止YM
13、DD野生株回复成优势株，一旦出现YMDD野生株成为优势株，改用Lamifudine或者联合Lamifudine和Adefovir抗HBV治疗是可取的。通过对YMDD变异的动态监测，有助于合理选择药物，长期使HBV处于低水平复制状态，甚至耗竭HBV cccDNA库，达到彻底消除HBV的目的。,3.常见检测方法 基因测序法 ELISA法 反向斑点杂交 先对YMDD区域进行扩增，以固相探针钓取生物素或其他活性物质标记的PCR产物，检测标记物。,Real-time PCR (1)探针法,图15. YMDD变异检测引物和探针设计,（2）融解曲线法,图16. 融解曲线法检测YMDD，单一产物,图17. 融
14、解曲线法检测YMDD，混合产物,1.X区突变 （1）基本核心启动子：控制核心RNA和前核心RNA的转录。核心RNA编码核心蛋白。前核心RNA编码e抗原前体。,五.HBVDNA其他突变,2.C区及前C区突变,3.S区及前S区突变 前S1蛋白在病毒侵入肝细胞过程中起重要作用，变异的病毒只要这一区段完好就有传染性。前S1蛋白在病毒感染、装配、复制和刺激机体产生免疫反应等方面起有十分重要作用。表面抗原为S蛋白，当S基因突变时，HBsAg结果为阴性，但前S1抗原结果此时可以为阳性。前S1抗原还是病毒传染性强弱的标志，如果前S1抗原阳性，即使e 抗原阴性，也同样可以认为病毒有很大传染性，因为e抗原经常会突变，导致检测不到。,谢谢！,
