噬菌体ppt-医学微生物学课件

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1、Bacteriophage 汇报人：孙建 金丽颖 果马,噬菌体概述,1,噬菌体展示技术,2,3,噬菌体载体,4,细菌的检测与治疗,5,噬菌体转导,第一章 噬菌体概述,分类,简史,概念,结构,特性,1.1噬菌体概念,噬菌体是感染细菌、真菌、 放线菌、螺旋体等微生物的 病毒，只能在活的微生物细 胞中复制增殖。,1.1噬菌体概念,噬菌体,分裂中的大肠杆菌,大肠杆菌 电镜扫描图,附在细菌上的噬菌体,噬菌体,1.2 噬菌体发展简史,1896年，英国细菌学家Hankin发现了水中存在抗细菌现象，并认为有种不明物质引起了这种现象。 1915年，英国Twort在葡萄球菌中发 现噬菌体。 1917年，加拿大人F

2、.d，Herelle在法国巴斯德研究所又独立发现痢疾杆菌噬菌体。,1.2 噬菌体发展简史,现象：本来混浊的菌悬液经一夜振荡培养后反而变清。为了弄清原因，他把变清的培养液用细菌过滤器过滤，并把滤液滴在痢疾杆菌菌液里，奇怪的现象再次发生。他还建立了空斑滴定法，此法简单，方便准确。至今仍是定量测定噬菌体浓度的有效手段，而且为动物病毒定量滴定所借鉴，建立了病毒空斑滴定法。,1.3 噬菌体的特性,1,2,3,个体微小、可通过细菌滤器,无细胞结构专性细胞内寄生,分布广泛,1.3 噬菌体的特性,裂解或不裂解细菌,4,5,6,有抗原性可刺激机体产生抗体,能够抵抗热、低温、冰冻等,1.4 噬菌体结构,1.5 噬

3、菌体的化学组成,核酸：头部核心，DNA或RNA 作用：噬菌体的遗传物质 蛋白质：头部外壳和尾部 作用：保护核酸 构成外壳和尾部,1.5噬菌体的化学组成,噬菌体的一些结构蛋白,1.6 噬菌体的分类,按照基本形态可划分为三类： 蝌蚪状（T4）、微球状（ x174） 和丝状（M13）。,根据噬菌体结构的不同可将其分为：,无尾部结 构的二十 面体,有尾部结 构的二十 面体,线状体,1.6 噬菌体的分类,迄今已知的噬菌体大多 数是有尾部结构的二十面体，到目前为止，研究者至少对5568种噬菌体进行了电镜观察，绝大多数(占96.2% )为有尾噬菌体。,1.6 噬菌体分类,按遗传物质类型进行划分： 线状双链D

4、NA（多数） 1.DNA噬菌体： 环状单链DNA（少数） 线状单链RNA（多数） 2.RNA噬菌体： 线状双链RNA（少数）,1.6 噬菌体分类,1.6 噬菌体分类,根据噬菌体与宿主的关系： （1） 烈性噬菌体：指感染宿主细胞后，能够使宿主细胞裂解的噬菌体。 （2）温和噬菌体：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合到宿主的核DNA上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。,1.7 噬菌体侵染细菌实验,烈性噬菌体侵染细菌的过程 （1）吸附 （2）注入 （3）增殖 （4）装配 （5）裂解,1.7 噬菌体侵染细菌实验,1.7 噬菌体侵染细菌实验,噬菌体的侵染实验

5、的结果 证明了DNA是遗传物质,1.7 温和噬菌体与菌细胞的作用,溶菌周期 溶原周期,第二章 噬菌体展示技术,1985年,Smith第一次 成功地将EcoRI核酸内 切酶基因插入丝状噬菌 体基因p中,并在噬菌 体表面表达出了融合的 蛋白。,2.噬菌体展示技术,噬菌体,Company Logo,？,噬菌体展示技术,2.1 噬菌体展示技术的发展,1988 噬菌质粒系统 1990 抗体片段的展示 1993 展示cDNA文库 1994 研发了phage two-hybrid技术 1996 首次体内in vivo 淘选试验 1998 噬菌体展示载体作为基因导入载体 1999 Combination of

6、 phage display with high-density arrays 2001 Automated phage display selection,2.2 噬菌体展示技术的原理,以噬菌体或噬菌粒为载体，将目标蛋白的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面，通过筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，并得到大量富集，从而获得目的多肽或蛋白质。,Company Logo,PIII,PIII,基因型,表达型,融合蛋白,2.3 噬菌体展示技术流程,Company Logo,2.4 常用的噬菌体展示系统,2.5 噬菌体展示技术的优点,非展示系统

7、 展示系统,2.5 噬菌体展示技术的优点,特定分子的基因型和其表型统一在同一个病毒颗粒内，将重组蛋白质筛选与基因筛选合二为一。 被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。 由于丝状噬菌体易于在大肠杆菌系统中分离扩增，因此此技术又合并了选择能力和扩增能力的优势，使得噬菌体展示技术成为高效的筛选体系。,操作简单易行，该技术采用经典的PCR分子克隆等技术即可操作，在几周内即可筛选106108克隆，筛选获得抗体库可以用于原核系统表达，无需组织培养，极大地降低了成本。 筛选获得噬菌体随机肽库具有容量大、体积小、筛选简便、制备成本低、可多次扩增等突出优点。,2.6

8、噬菌体展示技术的局限性,所建库的容量和分子多样性受到限制； 不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达； 噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。 由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。,2.7 噬菌体抗体库技术,它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与P或P相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。,2.7

9、噬菌体抗体库的分类,(1)根据 免疫抗体库 插入基 因片段 非免疫抗体库 天然抗体库 的来源 半合成抗体库 全合成抗体库 第一个合成的噬菌体抗体库是Barbas等1992年报道将合成的一小段CDR3片段。,Company Logo,2.7噬菌体抗体库的分类,（2）按抗体基因的动物来源分类 鼠源性抗体库 人源性抗体库 驼源性抗体库,Company Logo,从抗体库中可筛选多种重要的抗体，如膜蛋白抗原、自身抗原、病毒抗原的抗体。这些显示出抗体库技术的应用潜力。,实例,Burmester等构建了青霉素免疫单链抗体库； Yuan等从7个不同的人种,共47个健康人类的血液中提取基因,构建了人源天然单克

10、隆抗体噬菌体抗体库,第三章 细菌的检测与治疗,噬菌体感染相应细菌后，迅速繁殖并产生子代噬菌体。 利用该特性可将已知噬菌体加入被检材料中，如果噬菌体效价增强，就证明被检样品中有相应细菌存在。应用此原理可以对细菌进行检测。,3.1生物扩增法,原理： 当样品中的待检细菌数目较少时，将不利于噬菌斑的形成，影响检测结果。如果加入能够被噬菌体裂解的辅助菌，被侵染的待检细菌裂解释放出来的子代噬菌体会立刻继续吸附裂解辅助菌，从而形成清晰的噬菌斑。因此根据噬菌斑的数目检测样品中病原菌的含量。,将待检细菌的噬菌体与样品混合，37度培养1h，仅待检细菌被噬菌体吸附侵染,加入灭病毒剂灭活5min，灭活所有未侵染宿主细

11、胞的噬菌体；,将辅助菌加入到样品中，中和灭病毒剂，并立刻混合后倒入琼脂平板进行培养,释放出来的子代噬菌体裂解辅助菌；平板中形成清晰可见的噬菌斑。,3.1生物扩增法,该方法的关键是选择合适的灭病毒剂，其中化学试剂硫酸亚铁铵最为常用。利用该法已成功的检测出结核杆菌、沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌和弯曲杆菌等。,3.2荧光标记法,原理： 荧光标记检测技术是指利用荧光染料制备荧光噬菌体，利用这种噬菌体的荧光特性来检测病原菌的方法。 以食源性沙门氏菌的检测为例 鸡蛋中检测到的沙门氏菌,方法,荧光标记O-I噬菌 体的制备与收集,荧光标记的O-I噬菌体侵染宿主菌,荧光显微镜 观察结果,O-I噬菌

12、体液与1SYBRR染料，按101的比例混合,摇匀, 在暗处作用10 min,0.2m过滤收集荧光标记的噬体,1PBS缓冲液冲洗23次除去标记噬菌体后多余的染料,最后去离子水洗涤滤膜回收噬菌体,将待检样品于37静止培养6 h预增菌后，加入荧光标记的O-I噬菌体暗处侵染20min， 加入 4%多聚甲醛终止反应， 0.2m滤膜过滤收集,沙门氏菌阳性者均出现明显的杆状荧光，即带有荧光标记的沙门氏菌。,检测结果,荧光标记噬菌体O-I对食品样品检测结果,沙门氏菌,O-I 噬菌体,3.3与生物传感器联用检测方法,原理： 根据具有专一裂解特点的烈性噬菌体能够将特异性的细菌裂解释放出胞内物质（如酶），通过生物传

13、感器监控细菌胞内某种物质的信号变化，即可检测出致病菌。,利用这种方法可以在68h内检测出1CFU/100mL的大肠杆菌。 与生物传感器联用的噬菌体检测技术操作简单、分析速度快，但由于生物传感器抗干扰能力差、可靠性低，生物传感器在病原体检测中的应用受到一定的限制。,3.4应用报告噬菌体法检测致病菌,原理： 应用DNA重组技术将报告基因首先插入到噬菌体DNA上，将带有报告基因的噬菌体与待检样品作用，随着报告基因在宿主菌中的表达，目标菌体便可快速得到检测。,含有报告基 因的噬菌体,宿主菌,常用的报告基因有：,绿色荧光蛋白基因(gfp),2,细菌荧光素酶基因(lux),1,-半乳糖苷酶基因(lacZ)

14、,3,带有荧光素酶基因(lux)的噬菌体在体外不发光，但当该噬菌体吸附侵染宿主细菌后，发光基因得以表达，因此，噬菌体在宿主细胞体内可以发光。,含有gfp基因的噬菌体侵染特定的宿主菌后，该基因在宿主菌中表达并产生绿色荧光蛋白，再用荧光显微镜观察即可检测待检样品中有待检菌。,检测实例,E.coli用以上三种基因均可进行检测,噬菌体治疗,噬菌体对一些细菌 具有高度的专一性,当 噬菌体侵染细菌时,可 在细菌中繁殖并杀死 细菌;而它对动植物没 有毒性。根据噬菌体 的这一特性可对细菌 性疾病进行治疗。,早期噬菌体治疗,1917年,加拿大微生物学家Herelle在田野中进行了噬菌体治疗鸡沙门菌感染的研究，并

15、获得了成功。,1919年,1921年,Herelle在巴黎医院给一个患有痢疾的男孩实施抗痢疾噬菌体治疗,治疗后病人的症状消失并康复。,Bruynoghe和Maisin将噬菌体注射到外科手术伤口部位,治疗了葡萄球菌的感染。,噬菌体治疗感染的近期研究,3例确诊为结核性口腔溃疡患者采用分枝杆菌噬菌体软膏涂抹，均在1周内开始愈合，24周全部愈合。 刘晓彬等应用噬菌体治疗肠源性铜绿假单胞菌感染的动物模型，有明显的治疗作用。 Matsuzaki等采用噬菌体 MR11治疗金黄色葡萄 球菌的感染。,噬菌体治疗范围,噬菌体治疗敏感性致病菌的范围相当广泛，如葡萄球菌属细菌、埃希菌属细菌、克雷伯菌属细菌、变形杆菌属

16、细菌、假单胞菌属细菌、弧菌属细菌、放线菌属细菌、分枝杆菌属细菌等。 治疗的疾病包括化脓性伤口感染、胃肠炎、脓毒症、骨髓炎、皮炎、脓胸、肺炎、脑炎、细菌性腹水、痢疾和霍乱等。,噬菌体制剂,活噬菌体制剂,1,噬菌体尾部样细菌素,1,裂解酶制剂,2,是双链DNA噬菌体在自身复制晚期合成的一类细胞壁水解酶，能作用于细菌细胞壁的肽聚糖,破坏细菌保护层,所以可作为起杀菌作用的治疗药物。,是由噬菌体的碎片组成的高分子质量颗粒, 它能消除目标菌，从而达到治疗的目的，可由许多来自肠杆菌科和其他革兰氏阴性细菌的噬菌体产生。,噬菌体治疗较抗生素治疗的优势,噬菌体呈指数增殖，自我复制能力大，每一个裂解周期均能产生大量子代噬菌体 细菌很难对噬菌体