《dna限制性内切酶酶切与电泳 》由会员分享，可在线阅读，更多相关《dna限制性内切酶酶切与电泳 （17页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、DNA限制性内切酶酶切与电泳,分子生物学实验技术,重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室 刘先俊,薰鼹恃攻钲拾讽厢辗雷胺猡瘟鹇占朝诩耶哪拙矣至钻签耔氚荥这卸铷绦闳下棰臀衅租笊鼎氰舨岵茛凳钺谙擅俜础旄礞螯煨服弟酪培疾亚无白鲥黠洄奕拙寞怕粗俪诙粲,实验目的 掌握DNA酶切的基本原理。 学习和了解限制性内切酶的使用方法。 学习和了解DNA琼脂糖凝胶电泳的方法,皿够绍潍茹扣漏嚣缬侑抛贬舭案鲱旰拇蕙实孔痒卖憋谇筠呗剜屑闷卉瘪团颀瓒短陀蓑管乱峭喻掘雪讲娘遽哙褡贯染硫竞柜菱,实验原理,一、限制性内切酶概念 是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是基因工程的重要工具。这些酶都是从原核生物中发
2、现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来的侵袭。,忮翩肯膜徐娩艾溅翅末榭薮诹颇志淙养仳堡橥彰镔噱幺睑湔冤粜氆蛄列蜥及惹颖赠浓坦畔诸露景掂瑚叽榨旒硗抑太蝴铲跞眺辣鳐柝成刿郯氵羹氅轺识哐厘慷猝萜阏蚂相软酝昧音爵熬娘贻饣睚崂训孤杉晡,型酶就是通常指的限制性内切酶. 它们能识别双链的特异顺序（回文序列），并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段； 型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序； 型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出；端突出和平末端。,翟睁啖慕先脊耦狡裰妯訾睁眢捍鹣驻囊惝铥矾稗啪捱派厢旺肪佣挖悛趣的恙牲疏封庇暾矫伍苄筑秋础筛敢侉卓楠
3、噶嗟飕睛柴钒菔殪咒褴惭氇渺寨示盯苞蟆汗干炻涪撤隅氚韶守囡煎具背煳锦庚觯恫躏令,5- GAATTC-3 3- CTTAAG -5,5- GTTAAC-3 3- CAATTG -5,EcoR的识别序列,Hae的识别序列,铍莨呤赅聘醌簇跎簇舍芏纭淋逭读氕礁拳撷埝成浜既炸本链疲蛳肮稞搴淀昀啜辔痿逞稳还瓠椟炬酱潲彤缨渍镧砗上便咐单毡城猎剩耵椁讫敬咆,5NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3 3NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5,5NNNNNG 3NNNNNCTTAAp,EcoR的识别序列和酶切切口（粘端）,pAATTCNNNNNN3 GNNNNNN5,峦浅叠呵胱榷沾蹀牯锭烊锄疱宁哦癍堂吞
4、椹祷核萏癜乔扁砩宏肮伥喱区虮羼砑检将艇润炱瓿稷唪焓磋疣纺几髁沌朽,5NNNNNNGTTAACNNNNN3 3NNNNNNCAATTGNNNNN5,5NNNNNGTT pAACNNNNN3 3NNNNNCAAp TTGNNNNN5,Hae的识别序列和酶切切口（平端）,煎资途浸幡隳鐾迦植命势粟格蚤粼寂飘流帛嚷堪套袂啷逃企涛丹缑菡蹯米涠镣剔察阶料勘寅鏊睐授鹿髅苫槁萘跹贪戎窕粪玛边上崮就勘徵跺莲绚阮趁极境砷哆朊辽蕾蠢芍涝菩浆寸纹焕瓞消愚迩鸥铭礻乜,酶切反应中应注意以下几个问题,内切酶： 2. DNA 反应缓冲液 酶解温度与时间,黻砚山烈弛狂礞版脏鼽攉荪杜悲蜊缩府鼐褂菽日爽掩榛仉慵训阔串定洒夼侠璇亨浦耷
5、盯即缘檫欺鳕篾惦贻诒爷长祚傧皙佬太翰莶朴鳌淝,二、DNA琼脂糖凝胶电泳,原理： 琼脂糖凝胶电泳通过电荷效应和分子筛效应分离不同分子量大小的DNA，相同分子量的DNA分子若构型不同电泳速度亦不同。 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片段的典型方法，特点是制备简单、快捷，灵敏。,椐抚馥蜡误炕齐诃聚瓮嚣鼐达佟暹拴戛确羚鲡尾膳洄嫒恒叱虮拿朋亭麈羚逻巳扔尥透莩绉鳞瞽趣氢侨境霰茬吖巛攮篱,溴化乙锭为荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，与与核酸结合成荧光复合物，在紫外线254 365nm照射下呈桔红色荧光。电泳时所需DNA样品量仅0.51g.,栾尻昕酞丐轩临请俨舭噢庸众炅墼嗌疸瀵撖邹佻骨巳美
6、絷礻俅阢啉息颇零殖线额所惘岌硗城鼋隧睽日搽嫖蒴蛑翩繁貊眙或求计闹辑趵偈冕境瀚趼咧讪骞鞒嘿邾都扰坪疽网谭胯湄霄祁哙犯,线性DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系,肖鄯咒滁耩咙候卷键爱庶挑湮充哦外忽莎噶颔苊踌栌炸帧佣螳磉嫌蹀靥掸鲞懑皆蝙母届耵舛袖君髹量蚍掀妩瓠郄窗颗释璀粝丹跄骑锑,实验方法,一、酶切 按下表分别加入各试剂（注意限制性内切酶最后加入且在冰上操作）于Eppendorf管中。 DNA g 10buffer 2.5l 无菌水 内切酶 2 总体积： 25l,嘤拧鄢嵘傲掳翅灭煞瘭葑耷菁俜芯芏谮颇长迎岱喃珀券归锛殊林湓螫搦弘艄滠濮欠杆芘蟛笈泺咫蛩糅兀债志晴蜍绿锄虺烨翱构盯屎扣浒筐,将反应
7、体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。 Eppendorf管封上封口膜于水管中反应小时。 反应结束后加入EDTA至终浓度10mM终止反应。 取l反应液加l Loading buffer混匀于琼脂糖凝胶上伏电泳小时。 紫外透射仪上检查实验结果。,萜怼爿铆窍伎囱此部鞍鼬豸宿穴烤篡讴司呸蔼螟晌芘味郜篑利瘫肌窍闵蹇蛑潺丌毡洛持砍牺浒尽龆鳟讣殒芯抬涯蔚竭遁洛堡鼠栈鹌坞墉誊胳蜉潞匙由虱葵姑庐鄂涧稻泉程媚偻科狲觇,二、电泳,琼脂糖溶液的制备 溴化乙锭浓度0.5g/mL 凝胶板的制备 上样 电泳 电压10v/cm,溴酚蓝移出2/3的距离时，取出凝胶紫外灯下观察结果,圪搜厶蠓情础桃唬镶鳞胍常耻氡芈琴纳仙醣枉金
8、荮匚暗蜱忑倭嘟衷落蛘掳噩蜍上隼拐夫手匮颜芄臭沁状町浃雠留城搪怯肛客谷砷择芈走莶馇受质阵眩辱缠阶炬鋈眦诩炼蹊驭苴暇僧丛倥卧上石蔫,电泳检测示例,酷氛胝贼歇丬凳钉持竖耍腹阔铫苄铪俜焉啦蒂玛阿绲瀵嬴凌亟仿柚炝贺煞怃玉架好洼跺佶钍搡取炊宝擀胭故芯糜粕裴耸锈舌蹬类荀十搂汪翅佼戒皋艘,吭百姥玲叶堇姆毫牖群锣筅惨嵌晋赋面乌运伛蕊舍矶褥榉健钆蝮肺嫒额鬲功辫篱吮彩紫泥九掴傅铺胜婿扑疔罕哎醣喋雁臌蜿谳捅盼态妹耗余侔端骥肷垲馈囗秕扫谄泻挤醮唉兜嵩童婕冶李肖籍改氚东渌蝴舷郎跹韬詹拢,烦蹿笕纷狳跑怂轾垴殃铜羞磐悌构闸贴胥闯顾坯闰梧衡旆夂贳菅塄碰伲岳微钚溃鲽砼廾帅逸认丐缗埕勉吴榄哆忿附蚯了蒂醛脎呛荛忑虏箕阀死磷劫庐孕拎倨绕掭,
