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1、第二单元 cDNA的TA克隆 重组质粒转化大肠杆菌 提取质粒、酶切鉴定插入片段,生化系 谭红铭 L,实验的技术路线:,提取重组子质粒进行酶切鉴定。 重组子检测,T载体,cDNA（PCR产物）,连接,转化,胶回收,蓝白斑筛选法进行初筛，挑取阳性重组子，摇菌培养。,Steps in cloning a gene,实验六 cDNA的TA克隆,PCR产物的回收,一、实验目的,学习和掌握DNA片段胶回收的方法 学习DNA连接的有关技术,二、实验原理,Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，称为
2、T-A克隆, 它实际上是一种粘性末端连接, 因而具有较高的连接效率,可用于PCR产物的克隆和测序。,商品化的T载体有很多。本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。这个载体以pUC18载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoR酶切后在两侧的3端添上“T”制备而成。由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。,三、试剂与器材,一试剂 pMDTM18-T Simple Vector（TaKaRa） DNA凝胶回收试剂盒（Omega) 电泳缓冲液（1TAE） 琼脂糖；
3、溴酚兰；SYBR Green I* 2ul (SYBR Green I)+4ul (6loading buffer) +20ul DNA 混合均匀后点样,(二)器材,电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统 恒温水浴槽 移液器,四、操作步骤 DNA片段的胶回收,电泳洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法 冻融回收法 玻璃奶回收法 柱回收法（按说明书进行）,Gel Extraction Protocol,Omega Kit,1 把所割胶放入1.5mlEP管,称重。(预先称好空管重量)。 2 按1g/1ml 的量,加入Binding Buffer,55-65度水浴7min。（每隔23min，摇一下管） 3 把溶液
4、加入spin-column,10000g离心1min，去残液。 4 在柱子中加入300ul Binding buffer 。10000g离心1min，去残液 5 在柱子中加入700ul的SPW溶液，放置23min，10000g离心1min，去残液。 6 10000g离心1min（去乙醇） 7把柱子放入干净的1.5mlEP管。加灭菌ddH2O 20ul。50度放置1mins。10000g，离心1min。,胶回收注意事项,将电泳槽倒入新鲜配制的电极缓冲液； 根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板； 切胶时尽可能切掉不含DNA片段的凝胶； 使用长波紫外光（365nm) 尽量减少DNA在紫外下的照射时间
5、以减少对DNA的损伤； 熔胶要完全 。,实验七 感受态细胞的制备 和重组质粒的转化,一、实验目的,掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。 学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。,二.原理,质粒必须通过转化，才能进入细菌内进行扩增。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。用CaCl2处理细菌可以提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力,这种状态的细菌被称为感受态细菌。 CaCl2能使细菌细胞膨胀，细胞壁通透性增强，转移到42下进行短暂热刺激，待转化的外源DNA便会被细胞所吸收。 决定细菌转化效率（频率）的因素有：DNA的浓度、纯度和构型；转化细胞的生长状态；在CaCl2处理和储藏
6、之后的存活率以及转化的环境条件如：温度、pH值、离子浓度等。,三、试剂与器材,一试剂 LB液体（固体）培养基 LB/Amp/IPTG/X-Gal平板 IPTG储存液 X-gal储存液,(二)器材,37培养箱、水浴锅、恒温振荡器 分光光度计 离心机 微量移液器等,四、操作步骤,感受态细胞的制备 挑单个菌落接种到3 ml LB培养基中，37剧烈振荡培养过夜（12hr)。 取过夜培养物, 按1：50接种到50ml LB培养基中, 37振荡培养50分钟左右，直至培养液中细菌浓度达到OD600为0.2-0.4(细菌对数生长早中期，0.375)。 取1ml至1.5mL离心管中（三份），培养物冰上放置10m
7、in ， 5000r/min, 离心2min，收集菌体。,将菌体悬浮于500ul预冷的0.1mol/L CaCl2 中, 冰上放置10分钟。（小心用枪吹吸） 5000r/min, 离心2min，弃上清，然后将细菌轻轻悬浮在 100ulCaCl2 中（小心用枪吹吸） ，0-4 可保存2448hr（最好放置3hr以上再用）。,连接和转化,1）在微量离心管中配制5l溶液。 pMDTM18-T Vector 1l Insert DNA 2 ul dH2O 2l 2）加入 5 l（等量）的 Solution I（混匀）。 3）16反应 30 分钟。,4）全量（10 l）加入至 100 l DH5a感受态
8、细胞中，冰中放置 30 分钟。 5）42加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1分钟。 6）加入 890 l LB液体培养基，37振荡培养 60 分钟。 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8）挑选白色菌落，确认载体中插入片段的长度大小。,pMD18-T Vector 1 l（50 ng）的摩尔数约为 0.03 pmol。 InsertDNA使用量（ng）=nmol数660InsertDNA的bp数 在进行克隆时，Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔比一般为：1 ：210。,使用注意 1. Solution I
9、 请于冰中融解。 2. 克隆时使用的 Insert DNA 片段（PCR 产物）建议进行切胶回收纯化，否则 PCR 产物中的短片段DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质都会影响 TA 克隆效率。 3. 连接反应请在 25以下进行，温度升高（26）较难形成环状 DNA。连接效率偏低时，可适当延长连接反应时间至数小时。,倒置平板，37培养12-14小时。一般来说，含有活性半乳糖苷酶的细菌比无活性酶的细菌生长慢，故过夜培养后可见到毫米大小的阳性白色菌落而阴性的兰色菌落只有针尖大小。 挑取白色菌落进行鉴定。,转化及涂板设计: 样品: 样品5ul100ul感受态细胞-涂50ul、
10、100ul各一个平板 正对照: Plasmid 2ul100ul感受态细胞-涂50ul 负对照: 100ul感受态细胞-涂100ul,转化结果观察,次日，观察转化结果，计算转化率； 挑取转化子，划在新的LB-amp平板上培养过夜，保存于冰箱中，待用菌进行检测（见下一实验）。 讨论,转化效率的计算 Ex：取 0.1 ng的 Plasmid DNA加入至 100l感受态细胞中后，再加入 900 l的LB培养基（0.1 ng DNA/ml），将上述培养液稀释 10倍后（0.01 ng DNA/ml）取 100 l涂布平板（0.001 ng DNA/100 l） ，记录菌落数。以得到 200 个克隆体
11、为例计算转化效率， 转化效率=200cfu/0.001ng =2105cfu/ng =2108 cfu/g 质粒DNA,时间安排:,第一天 上午 配培养基、试剂并灭菌 下午 倒Amp平板，接DH5a 第二天 电泳胶回收（同时制备感受态细胞）、连接转化（平板涂Xgal和IPTG） 下周一(10月28日)下午四点,每组派同学 挑克隆子摇菌 下周二 提取质粒DNA，酶切鉴定,忙碌的第二天(合理安排时间):,上午：倒胶制板,其他同学取1ml菌液加入到50mlLB液体培养基中,37度摇菌至OD=0.2-0.4,另一部分同学等胶凝固点样跑电泳,电泳等待时制备感受态细胞备用。电泳完毕，胶回收。 下午：连接、
12、转化，涂板。（平板预先涂xgal和IPTG） 晚上六点后37度培养过夜。,培养基配制,装枪头，1.5 / 0.5 ml离心管,每组4个带塞子试管,灭菌 玻璃珠，用50mL尖底离心管装，灭菌，涂布平板用(全班两瓶） 0.1mol/L CaCl2: 100 ml ，感受态制备用， 灭菌超纯水: EP管装纯水 5mol/L NaOH, 50mL,调节LB培养基pH值用，全班用 配氨苄青霉素：100mg/ml 过滤灭菌. 装牙签 配LB培养基（感受态制备和转化用） 液体：全班？mL 50ml 16瓶， 100ml 2瓶制备感受态细胞用 固体（含2%琼脂粉）： 每组100 ml，共1000ml，可一起配
13、再分装 每组倒6个平板（ Amp+），用于第二天的转化,IPTG储存液：200mg/ml的双蒸水溶液，用0.22m的一次性滤器过滤除菌，-20 保存。 X-gal储存液：20mg/ml的二甲基甲酰胺溶液，不必除菌， -20 避光保存。,LB培养基配制,在950ml水中加入: bacto-tryptone 10g bacto-yeast extract 5g NaCl 10g 用5 mol/L NaOH调pH至7.07.2 加水至1L,121C高压灭菌15min。,LB/Amp平板制备,在950ml水中加入: bacto-tryptone 10g bacto-yeast extract 5g N
14、aCl 10g 用5 mol/L NaOH调pH至7.07.2 加水至1L,分装后加2%琼脂，高压灭菌，冷却至55,加氨苄青霉素至终浓度100g/ml,立即倒平板，每皿约2030mL。,实验八 重组克隆筛选（质粒提取、酶切鉴定）,一. 目的 掌握质粒提取的基本方法的原理； 学习和掌握限制性内切酶的使用方法。,二.原理,常用的筛选方法有两类。一类是针对遗传表型改变筛选法，以半乳糖苷酶系统筛选法为代表。另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交等方法。,蓝白斑筛选原理,载体带有一个大肠杆菌的DNA的
15、短区段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋,白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为-互补。由-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致无-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。,IPTG和乳糖的结构相似，所以它和乳糖一样，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。与乳糖不同的是，IPTG不被 -半乳糖苷酶水解。常与X-GAL一起用于蓝白斑筛选。 X-Gal是-半乳糖苷酶(-galactosidase)的显色底物，在-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。,限制酶图谱鉴定 对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒
