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1、实验一 酵母细胞的固定化 及其酒精发酵试验,食品专业综合实验,2,（一）酵母菌酒精发酵 在无氧条件下，酵母菌利用葡萄糖或淀粉水解糖发酵产生乙醇和CO2的作用，称为酒精发酵，总反应式为： C6H12O62C2H5OH+2CO2 酒精发酵是生产酒精及各种酒类的基础。本实验采用固定化酵母发酵，通过测定发酵过程中的酵母细胞数、生成的CO2量以及最终产物酒精的量，可以判断固定化酵母的发酵能力。,二、实验原理,3,微生物细胞的固定化方法有： （1）吸附法， （2）包埋法， （3）化学结合法。,包埋法,4,（二）细胞固定化技术 固定化细胞就是被限制自由的细胞。即采用物理或化学的方法将细胞固定在载体上或限度在
2、一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并能反复或连续使用。,二、实验原理,游离细胞 固定化细胞,5,本实验采用凝胶包埋的固定化方法，把酵母细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，再滴加入CaCl2溶液，形成海藻酸钙凝胶小球，细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。,注意：已通过审查的学生设计方案， 可以按照自己设计的方法进行； 未通过的按实验讲义操作。,6,三、实验器材,1. 酵母菌细胞：酒精活性干酵母。 2. 2.5%海藻酸钠溶液40mL，2 % CaCl2溶液100mL。 3.培养基： 增殖培养基：浓度为130BX麦芽汁，以6N硫酸调节pH值至4.14.5。（每组100mL装于250mL三角瓶， 1kg
3、/cm2，灭菌30min后备用） 发酵培养基：淀粉水解液，具体制备见实验步骤。 4. 培养箱、显微镜、蒸馏装置及其他常规实验仪器,7,（二）干酵母活化 称取2g活性酒精干酵母； 加入到2%、 50mL蔗糖溶液中； 在培养箱中32活化1h左右； 离心（3000r/min、10min），弃去上清液； 湿酵母备用。,四、实验方法,8,（三）固定化操作 将酵母湿细胞与40mL海藻酸钠溶液混合均匀； 用注射器 （不用针头）将海藻酸钠酵母菌混合 液点滴滴入CaCl2溶液中，形成球状颗粒； 常温下静置2h，使其充分固化； 滤出凝胶颗粒；用无菌水洗涤23遍，即得固定化 酵母细胞。,四、实验方法,9,（四）固定
4、化酵母的增殖 将固定化颗粒投入增殖培养基中进行增殖， 28、120r/min下增殖24h。定时采用血球记数板测定酵母细胞数。,（五）固定化酵母的分批酒精发酵 将增殖后的固定化酵母颗粒，置于三角瓶发酵培养基中（安装下图），30进行酒精发酵，发酵时间48h左右。定时记录发酵液的糖度及细胞数的变化。,四、实验方法,10,（七）酒精度的测定 先装好蒸馏装置（参见下图）；取酒精醪液l00mL，加蒸馏水l00mL，于500mL蒸馏瓶中蒸馏，取100mL馏分，用酒精比重计测量酒精浓度；同时测温度，查表换算成20的酒精度。,四、实验方法,1.掌握微生物细胞的固定化方法； 2.学习用固定化酵母进行酒精发酵； 3
5、.进一步理解淀粉质原料酒精发酵的原理 和一般工艺过程。,一、实验目的,本实验为设计性综合实验 已提前安排学生查阅资料、自行设计酶或细胞的固定化方法。大多数同学的设计方案较为可行，具体情况已反馈给大家了。,12,最令人感兴趣的是固定化增殖细胞，因为多数微生物代谢的产物与其生长相关。,微生物在固定化后以其生长状态可分为3类： 固定化死细胞； 固定化活细胞（休眠状态）； 固定化增殖细胞（生长状态）。,13,四、实验方法,（一）淀粉的液化与糖化（双酶法）, 调浆:以133.5的比例，将玉米粉（或玉米淀粉）用60左右的温水调成粉浆500mL; 液化：加-淀粉酶（用量约为10u/g淀粉）；加热至8590，
6、保持3060 min，加热煮沸10 min，补充水分。 糖化：将上述液化醪冷至6062，加入糖化酶，用量为80100u/g淀粉，维持30 min后分装于500mL三角瓶，每瓶装糖化醪250mL。 糖化醪质量检查：要求糖度1617BX，还原糖46%，酸度23。,14,（六）CO2生成量的测定 按右图安装测定装置。培养前，揩干三角瓶外壁，置于天平上称重，记下重量为W1；培养结束后，取出三角瓶轻轻摇动，使CO2尽量逸出，在同一架天平上再称重，记下重量为W2，则：,二氧化碳生成量 W1 W2,15,1.记录定时测定的酵母细胞数； 2. 二氧化碳生成量= 克。 3.蒸馏液的酒精度= 度，温度为 ，换算为20的酒精度为 度。,五、实验结果记录,16,六、思考题 影响固定化增殖细胞生理活性和发酵性能的因素有哪些？,
