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1、第二章 动物检验检疫技术,食源性疾病尤其是动物性食品引起的疾病在全球范围内呈上升趋势。造成食源性疾病的主要原因是食品及其原料的生物性污染和化学污染。 大多数的食源性疾病是由病原生物引起。主要包括： 本章将重点介绍检验检疫样品的采集，以及病原微生物的分离及鉴定方法 了解常用的检验检疫技术，如免疫技术，PCR技术，核酸杂交技术等。,第一节 检验检疫样品,一、病料采集和运送 采集和运送不得当，影响病原菌的分离。 采集前了解不同病原菌在动物体的分布情况。 取样时应注意： 1.对疫病作初步诊断。 2.采样器械需提前灭菌，操作时应戴手套、口罩等，进行无菌操作。,煮沸消毒：沸水30min， 用前酒精擦拭，火
2、焰烧一下,0.5%石碳酸水溶液煮沸10min,高压湿热灭菌121 ，30min；或者是干热灭菌135-140灭菌3-5h；160-170灭菌2-4h；180-200灭菌0.5-1h,不同材料灭菌方法,3.解剖前检查 急性死亡动物解剖前先用显微镜查其血液抹片，检查是否有炭疽杆菌存在。 炭疽死亡的动物尸体不能解剖，因为： （1）炭疽是各种家畜、野生动物及人共患的一种传染病，人可经皮肤局部感染而造成死亡。 （2）病死畜体内及其排泄物常含有大量菌体，当尸体处理不当，形成大量有强大生命力的芽孢污染土壤、水源、牧地等则可成为长久的疫源地。 证明非炭疽杆菌后，采取有病变脏器或者组织送实验室，证明其病因。,炭
3、疽杆菌,4.取材时间要早 为了避免微生物的污染，应尽早取样，尤其是动物内藏病变组织，应在患病牲畜死后立即进行，最好不超过6h。夏季要在动物死亡后2h内采取病料;剖开腹腔后,首先取材料,再作检查,因时间拖长后肠道和空气中的微生物都可能污染病料。已腐败变质的畜尸不能采取病料。作细菌学培养的则应采用未使用过治疗药物的病畜。 5. 不同疫病的采样 不同样品的采集方法见下页表。 6.脓、血液及黏液膜片的制作,不同样品的采集方法,检验检疫样品,二、病料的保存 病料采集后，若不能及时送检，需加入适量的保存剂，使病料新鲜。 1.细菌材料的保存,饱和NaCl溶液：蒸馏水100mL, NaCl 38-39g，溶解
4、后，高压灭菌。 30%甘油缓冲盐水溶液：纯中性甘油30mL、 NaCl 0.5g、碱性磷酸钠 1.0g、0.02%酚红1.5mL、中性蒸馏水100mL,溶解后灭菌。,检验检疫样品,2. 病毒检验材料的保存,50%甘油缓冲盐水溶液：纯中性甘油150mL、 NaCl 2.5g、酸性磷酸钠 0.46g、碱性磷酸钠 10.74g、 蒸馏水150mL, 溶解后灭菌。,鸡蛋生理盐水： 鸡蛋表面消毒 打蛋入灭菌容器 加入总量十分之一的灭菌生理盐水混匀 56-58,30min 第二天和第三天重复加热,检验检疫样品,3. 病理组织学检验材料的保存 4.寄生虫学检查材料 第一,血液寄生虫(如血孢子虫),需送检血片
5、及全血。 第二,线虫(绝大部分在胃肠道,也有的在肺、肾等处)主要是挑拣虫体（要注明采集的部位）,尽可能多拣一些,并把它保存在4%福尔马林或70%的酒精中。,10%福尔马林溶液： 40%甲醛溶液(10ml)+水(90ml) 甘油和10%福尔马林溶液混合可用于在冬季保存组织块,以防组织块冻结.,检验检疫样品,三. 病料送检 装病料的容器上要写明编号，附上病料详细记录和送检单。应注明所采家畜的品种、年龄、发病情况、死亡时间、流行病学特点、采集时间、采集地点、畜主、送检目的、病料名称、保存液等细资料。还应注明送检单位、地址、送检日期、送检者姓名及电话号码等。 送检病料应按要求包装，如微生物检验材料怕热
6、，应用水瓶冷藏包装。病理材料怕冻应放入保存液包装后送检等。 500g氯化铵加1500mL水可使瓶内水在0保持24h。,检验检疫样品,三. 病料送检 涂片自然干燥,在玻片之间垫上半节火柴棒,避免磨擦,将最外的一张倒过来使涂面朝下,然后捆扎,用纸包好。 装在试管、广口瓶或青霉素瓶内的病料，均需盖好盖,或塞好棉塞,然后用胶布粘好,再用蜡封固,放入保温箱中,盛病料的容器均应保持正立,切勿翻倒,每件标本都要写明标签。 病料经包装装箱后，要尽快送到检验单位，最好派专人送去，长途最好空运。,第二节 细菌分离与鉴定,一、无菌技术,由于微生物在自然界分布非常广，因此细菌的分离培养必须在无菌条件下进行，以防止外界
7、微生物的污染。 无菌操作场所在使用前需用紫外灯照射30-60min 操作台面使用前，70%酒精擦拭灭菌 所有需要用到的物品如平板、培养基等使用前灭菌 操作人员工作前清洗双手，然后用70%酒精消毒 灭菌的试管打开和关闭时需在火焰上通过一两次，以保持无菌 接种工具使用前后需火焰灭菌 分装培养基、倒平板、接种等操作需在无菌场所进行 从动物体内抽血或接种时，应先剪去局部毛，再进行常规消毒。 工作完毕，室内空气用紫外灯照射30min,二、接种工具,接种针：穿刺接种 接种环：液体接种，划线分离 金属接种环：可重复利用，使用前后在火焰上灭菌 塑料接种环：避免交叉污染，一次性，成本较高,接种铲：用于不易挑起的
8、菌落的接种,涂布棒：用于使菌体在培养基表面分布均匀 玻璃涂布棒：使用前浸入90%酒精，使用时在火焰上点燃，待酒精燃尽，冷去后方可使用。,三、无菌操作场所,紫外灯,无菌过滤气流,外门,内门,紫外灯，空气过滤装置,四、细菌培养基,培养基（Medium）：是供微生物生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。,细菌培养基（ATCC 573） （NH4)2SO4 1.3g K2HPO4 0.37g MgSO4.7H2O 0.25g CaCl2.2H2O 0.07g FeCl3 0.02g 葡萄糖 1.0g 酵母膏 1.0g 蒸馏水 1000ml
9、 用10N H2SO4 调pH至4.0。若配制半固体，加入琼脂3-10g/L，若配制固体培养基，加入琼脂16-20g/L。,有的培养基需要加入抑制剂以选择性的抑制其他菌的生长。指示剂，用于细菌的快速鉴定,培养基的分类,按培养基功能分 基础培养基（basic medium)：含有细菌生长繁殖所需的基本营养物质，可供大多数细菌生长。如营养琼脂培养基。 加富培养基(enrichment medium) ：也称营养培养基，即在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基。这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。,培养基的分类,按培养基功能分 选择性培养基（selecte
10、d medium）：一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于菌种筛选等领域。 鉴别培养基（differential medium）：一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。例如，伊红美蓝乳糖培养基（EMB）。,鉴别培养基,EMB,按成分分： 天然培养基 指一类利用动、植物或微生物体包括其提取物制成的培养基。如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。 组合培养基 又称为合成培养基或综合培养基，是一类按微生物的营养要求精确设计
11、后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等。 半组合培养基 指一类主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基。例如，马铃薯蔗糖培养基。,按物理性质分：,固体培养基,半固体培养基,液体培养基,五、病料的处理,无菌采集 被污染样品： 选择性培养基或增菌培养基分离病原菌。 菌量少的样品： 离心，取沉淀 不易分离的样品： 将病料组织研磨，加入酶、酸等处理组织，使菌分散，然后离心（肠粘膜分离副结核杆菌）,六、细菌的分离方法,细菌接种保存方法,七、细菌的培养,需氧培养法：适合需氧菌和兼性厌氧菌的培养。一般的培养箱都可用于需氧培养 CO2培养法：用于某些有特殊要
12、求的细菌的培养，如牛流产布氏杆菌，需要在含有10% CO2的空气中才能生长。常用的培养装置：CO2培养箱。 无培养箱时，可用烛缸法和化学法（NaHCO3-HCl）代替。 厌氧培养法：用于厌氧菌分离培养。常用的装置有厌氧培养箱，厌氧培养罐和厌氧袋法。 厌氧袋法-操作简便，不用加水、不用催化剂，只需把药剂(产气袋)外袋剪开放入容器内，密封后即可形成适宜的厌氧、微需氧、二氧化碳培养环境。,厌氧培养箱,CO2培养箱,厌氧培养罐,厌氧袋,八、细菌的鉴定,细菌菌落形态,颜色 形状 大小 边缘 隆起度 透明度 质地 黏度,单菌落在平板划线后，一边24-48h单细胞会形成单个菌落，生长较慢的菌株可能需要72h
13、或更久。不同种属之间会表现出不一样菌落形态。,1,2,3,4,5,6,细菌在培养基中的生长情况,浑浊生长,产气,产色素,穿刺生长,沉淀，浑浊，表面生长,细菌显微观察,由于细菌个体微小，需借助显微镜对菌体的形状、大小进行显微观察。一般细菌用显微镜放大倍数10*100倍。细菌显微观察前先进行染色，才能将细菌形态观察的更清楚。,细菌染色一般程序,使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘得更牢固； 可改变菌体对染料的通透性 ； 加热固定可杀死细菌，比较安全。,细菌染色,革兰氏染色法,革兰氏染色结果,芽孢染色法,枯草芽孢杆菌培养16h染色结果,显微镜,1,3,2,4,5,6,7,8,9,1. 目镜 2. 转换器
14、 3. 接物镜 4. 载物台 5. 光圈 6. 反光镜 7. 粗调焦距 8. 细调焦距 9. 标本移动器,染色结果观察,鞭毛,芽孢,荚膜,杆菌,球菌,杆菌,细菌鉴定,生化试验结果,糖发酵实验,指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝,细菌鉴定抗原检测及血清型鉴定,细胞壁菌体抗原O抗原 鞭毛抗原H抗原 特异性抗原：荚膜抗原-炭疽杆菌 Vi抗原沙门氏菌 K抗原大肠杆菌,细菌鉴定遗传物质检测,PCR,细菌鉴定遗传物质检测,DNA探针技术,细菌鉴定细菌毒力测定,病原性细菌致病能力的强弱程度称为毒力。 通常用来表示细菌毒力大小的单位最小致死量（MLD）和半数致死量（LD50） 最小致死量（MLD， minimum lethal dose ）：能使特定的动物感染后，在一定时限内发生死亡的最少活的细菌量或毒素量。 半数致死量（LD50， median lethal dose ）：在一定的时限内能使半数实验动物感染后发生死亡所需的活得细菌量或毒素量。,
