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1、,第五节 糖的核磁共振性质,一、糖的1HNMR性质 1、糖的端基质子信号在5.0ppm附近，多数呈现特征性的双峰，少数呈现宽单峰。 2、糖环质子信号在3.54.5ppm之间。 3、甲基五碳糖（如鼠李糖）的甲基质子信号在1.0 ppm附近.,（ ）,4、糖的C1-H与C2-H的偶合常数，广泛应用于 吡喃糖环端基碳原子构型的判断。 原理：绝大多数的D-吡喃糖(如葡萄糖),当 C1-OH处于横键上(代表-苷键),C1-H与C2-H的 偶合常数J=6-8Hz; 当C1-OH处于竖键上(代表 -苷键),C1-H与C2-H的偶合常数J=2-4Hz。 原因：质子间的偶合常数与两面角有关。, C2-H始终处于
2、竖键上是判断的前提。 甘露糖与鼠李糖，虽然具有吡喃环结构，但其C2-H都处于横键上，故无法判断其苷键构型。,2,2, 鼠李糖优势构象是1C式,1,2,1,2,1,1,2,2,3,3,（ ）,-L-鼠李糖苷,-L-鼠李糖苷,=60,0,=60,0,C1,二、糖的13CNMR性质 （一）化学位移与偶合常数 1、D-吡喃糖的化学位移值 C1: -型 97101 ppm -型 103 106 ppm CH-OH(C2、C3、C4) 7078ppm CH2-OH (C6) 62ppm左右 CH3（糖的甲基C） 18ppm左右, 一般在13C-NMR谱中,2、D-呋喃糖的化学位移值 CH2-OH (C1)
3、 64 ppm左右 CH-OH（C3、C5） 80ppm（偏大）,3、13C谱化学位移数据的应用 依据97 106ppm区域13C信号的个数可 判断低聚糖及其苷中所含糖基的个数. 如果端基13C信号出现在大于100ppm的 区域，则苷键构型为-D或-L； 如果端基13C信号出现在小于100ppm的 区域，则苷键构型为-D或-L。, 依据13C谱数据尚可判断氧环的大小。 对于呋喃氧环 CH-OH（C3、C5） 80ppm 对于吡喃氧环 CH-OH（C3、C5） 78ppm,4、吡喃糖中端基碳的C-H偶合常数(1JC1-H1) 可用于苷键构型的确定. 对于D-吡喃糖甲苷： -苷键 JC1-H116
4、5170Hz -苷键 JC1-H1155160Hz 例如：-D-甘露糖甲苷 1JC1-H1=166ppm; -D-甘露糖甲苷 1JC1-H1=156ppm。, 对于L-鼠李糖甲苷： -苷键 JC1-H1165170Hz -苷键 JC1-H1155160Hz 例如： -L-鼠李糖甲苷 1JC1-H1=168ppm; - L-鼠李糖甲苷 1JC1-H1=158ppm。 5、呋喃型糖苷无法用端基碳与端基质子 的偶合常数来判断其苷键构型。,（二）苷化位移（glycosydation shift） 1、概念：糖成苷后，糖的端基碳和苷元-C、 -C的化学位移值均发生改变，这种苷化前后 化学位移的变化现象，
5、称为苷化位移。,端基碳,苷元碳,2、苷化位移一般规律 端基碳、苷元-碳的化学位移值向低场 方向移动56ppm（+5+6）单位； 苷元-碳的化学位移值向高场方向移动 34ppm（-3-4）单位； 糖分子其他碳原子化学位移值变化不大。 苷元-位有取代基时的苷化位移规律：, 苷元-碳和糖端基碳绝对构型都为R （或S）时，苷化位移规律同、。,端基碳,-碳,-碳, 苷元-碳和糖端基碳绝对构型不同时， 端基碳和-碳的苷化位移值比苷元-位 无取代基者大约高3.5ppm单位。,端基碳,-碳,3、酯苷、酚苷的苷化位移规律： 苷化位移值较特殊，端基碳与羰基碳（即苷元-碳）均向高场方向位移，-C向低场方向位移。 例
6、如：齐墩果酸在成苷后，其分子结构中既含醇苷、也有酯苷结构。可用于对比有关碳原子化学位移值的变化情况。,端基碳,端基碳,-C,-C,-C,-C,-C,-C,-C,-C,4、苷化位移有关说明： 苷化位移值与苷元的结构有关， 与糖的种类无关。,-D-葡萄吡喃甲苷 13C1=104.0ppm,-D-甘露吡喃甲苷 13C1=104.5ppm, 如果苷元为链状结构，则糖端基碳的苷化 位移值随着苷元为伯、仲、叔基而递减。 例如：与糖的甲苷化学位移比较，苷元 分别为伯、仲、叔基时，糖端基碳的苷化 位移值的变化情况如下，,端基碳化学位移值下降,-2,-4,-7, 在被苷化的糖分子结构中，通常与端基碳直接相连的-
7、C的化学位移变化较大些，-C稍受影响，其他碳原子受到的影响则较少。 在确定了苷中糖的种类以后，将苷的13C谱 数据与相应单糖的13C谱数据进行比较，利用 苷化位移规律可确定苷中糖的连接位置。,例如：判断双糖苷中两单糖的连接位置 将双糖苷的13C谱数据与相应单糖的13C谱 数据进行比较； 如果内侧糖的某个碳原子的化学位移向 低场方向移动了（通常是47ppm), 而与其 相邻的两个碳原子之化学位移值又略向高场 方向移动（约12ppm), 则内侧糖的这个碳 原子就是糖的连接位置。,三、红外光谱IR,1.37003100cm-1间有明显O-H吸收峰。 2.如糖分子中含羧基、酰基等，则相应官能团 的IR
8、吸收峰可见。 3.多糖在1500960cm-1有许多吸收峰，其中 970730cm-1间的峰可用作端基碳构型判断。 例如：840cm-1吸收峰 -L-吡喃糖苷 890cm-1吸收峰 -D-吡喃糖苷,四、质谱,1、糖类难挥发，且热不稳定，需要制成挥发 性的衍生物才能进行质谱分析。 2、糖的立体异构体往往出现几乎相同的质谱， 仅在碎片丰度上稍有区别（不能用质谱来区别 糖的构型！）。 3、糖和苷的分子量：可用CI(化学电离), FD-MS 、FAB-MS等方法获得分子离子峰后测出。,4、软电离方式得到的碎片峰很少，但有可能获得从分子离子峰按顺序失去一个个糖基后的碎片离子峰。 如果事先测定了多糖的组成
9、，则可根据质谱的碎片离子峰信息来推断原糖链的连接顺序。,第六节 糖链的结构测定, 主要解决四个问题 单糖的组成； 糖的氧环大小； 糖与糖之间的连接位置和顺序； 苷键构型。,（一）纯度测定方法 1、高压电泳法 原理：由于中性多糖导电性差、分子量大、 在电场中的移动速度慢，常将其制成硼酸络合 物进行高压电泳。 电泳支持体：玻璃纤维丝、纯丝绸布等。 缓冲液：pH=9-12的硼砂溶液。 电压：30-50V/cm, 时间： 30-120min 显色剂：p-甲氧基苯胺-硫酸。 注意：必须使用冷却系统，将温度维持在 0,以免烧坏支持体。 本法常用 2、超离心法 原理：由于微粒在离心力场中移动的速度 与微粒的
10、密度、大小与形状有关，故将多糖,溶液进行密度梯度超离心时，如果是组成均一 的多糖，则应呈现单峰。 具体做法： 将多糖样品制成1%-5%的氯化钠或tris-盐 溶液，接着进行密度梯度超离心，待转速达到 恒定后（6000转/min），采用间隔照明法 检测其是否为单峰。,3、旋光光度法 在多糖水溶液中加入乙醇使其浓度达到10% 左右，离心得沉淀。上清液再用乙醇使其浓度 达到20%-25%左右，离心得到第二次沉淀。 比较两次沉淀的比旋光度，如果比旋光度相同 则为纯品，否则为混合物。 4、其他方法 如凝胶柱色谱、官能团摩尔比恒定法等。,（二）分子量测定 1、测定多糖分子量物理方法： 沉降法、光散射法、黏
11、度法和渗透压法等。 2、凝胶过滤法简介： 在凝胶柱上不同分子量的多糖与洗脱体积 成一定的关系。采用一系列结构相似的已知分 子量的多糖做标准曲线，进而测定样品多糖的 分子量。 该法用量小、操作较简便。,3、单糖、低聚糖及其苷分子量的测定 最常用FD-MS、FAB-MS与电喷雾-MS 4、多糖分子量的测定方法 基质辅助激光解析电离质谱 （MALDI-MS） 基质辅助激光解析飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS).,（三）单糖的鉴定 1纸层析 展开系统：常用水饱和的有机溶剂 如：正丁醇：醋酸：水（4：1：5上层）BAW 正丁醇：乙醇：水（4：1：2.2）BEW 展开方式：上行、下行等 显色剂：可
12、利用糖的还原性或形成糠醛后 引起的一些呈色反应。例如，, 邻苯二甲酸苯胺 硝酸银试剂（使还原糖显棕黑色） 三苯四氮唑盐试剂 （单糖和还原性低聚糖呈红色） 3,5-二羟基甲苯-盐酸试剂 （酮糖呈红色） 过碘酸-联苯胺（糖、苷和多元醇中有邻二-OH结构显兰底白斑）。,2薄层层析 采用（硼酸液/无机盐）+ 硅胶 制板 吸附剂：硅胶 显色剂： 除纸层析应用以外，还有H2SO4/H2O或 乙醇液、茴香醛-硫酸试剂、 苯胺-二苯胺磷 酸试剂等。,3气相层析 将糖制备成三甲基硅醚 醛糖用NaBH4还原成多元醇，制成乙酰化物或三氟乙酰化物。 4离子交换层析 原理： 糖的硼酸络合物可进行离子交换层析, 优点：不
13、必制成衍生物，而直接用水溶液 进行分离（与气相比较） 需要仪器糖自动分析仪 5液相色谱 填充材料化学修饰的硅胶 优点：不必制备成衍生物。适合分析对热 不稳定的、不挥发的低聚糖和多糖。 缺点：灵敏度不及气相层析高。, 多糖组成的鉴定 1、必要性：低聚糖、多糖的结构分析，首先要了解由哪些单糖所组成、各种单糖之间的比例等。 2、多糖组成鉴定过程：将苷键全水解，用PC检出单糖的种类，经显色后用薄层扫描仪求得各种糖的分子比（也可用GC或HPLC对各单糖定性定量分析）。,（四）糖连接位置的测定 1、化学方法：多采用甲基化法 过程：将糖链全甲基化，然后水解所有的苷键，用气相色谱法对水解产物甲基化单糖进行定性
14、和定量分析。 甲基化过程：常用箱守法(Hakomori) 水解过程：通常先用90%甲酸全水解，然后用0.05mol/L H2SO4或三氟乙酸水解。, 气相色谱法定性和定量分析： 选择各种单糖的标准品，分别与水解后得到的各种甲基化单糖进行比较，具有游离-OH的部位就是糖的连接位置，而全甲基化的单糖即为末端糖。 计算过程： 算出所得各甲基化产物相互之间的比例，据此可推测出糖链重复单位中各种单糖的数目。,全甲基化 水解,游离羟基,游离羟基,（ ）,2、NMR谱法（了解内容） 13CNMR谱法： 目前用来确定糖的连接位置的常用方法 该法是在归属各碳信号的基础上，以游离苷元和甲基糖苷作为参考化合物，确定产生苷化位移的碳，然后利用苷化位移规则，即可方便地获知各单糖的连接位置。, 1HNMR谱法： 先使糖与苷乙酰化，再比较不同类型质子的化学位移。 例如：CHOAc中CH质子的化学位移为4.755.4ppm; 而CH2OAc、CH2OR中质子在3.04.3ppm；端基质子介于这两者之间。 通过2D-NMR判定质子的归属，从而得出糖的连接位点。,（ ）,
