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1、荧光免疫技术 fluoroimmunoassay,免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。 免疫荧光技术包括荧光抗体技术和荧光抗原技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。,该技术的主要优缺点 主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。 主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解 决，结果判定的客观性不足， 技术程序也还比较复杂。,基本原
2、理 免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。,以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。 在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。在实际工作中，由于用荧光素标记抗体检查抗原的方法较为常用，所以一般通称为荧光抗体技术。,第一节 荧光的基本知识 一、 荧光 荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是一种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。,二、荧光技术中有关的概
3、念和参数 发射光谱 指固定激发波长，在不同波长下所记录到的样品发射荧光的相对强度。 激发光谱 指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。 荧光效率 指荧光物质将吸收的光能转变成为荧光的百分率。 荧光效率=,发射激光的光量子数（荧光强度）,吸收光的光量子数（激发光强度）,4 荧光寿命 指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰退到一定程度所用的时间。,荧光的猝灭 指荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会发生减弱的现象。 荧光偏振 P=,FH-FL,FH-FL,P：偏振度； FH:表示激发光起偏器和荧光检偏器的透射轴方向平行时测得的荧光强度；
4、 FL：表示以上两者方向相互垂直时测得的荧光强度。,P=0,完全不偏振 P（-1，+1），部分偏振,三、荧光物质 1 荧光色素 能够产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于标记抗体的荧光色素，必须具有化学上的活性基因，能与蛋白质稳定结合，且不影响标记抗体的生物活性及抗原抗体的特异性结合。,荧光色素的标记 目前适于标记蛋白的荧光色素主要有： 异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate， FITC） 四乙基罗丹明（rho-damine B200，RB200） 四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isotheynat
5、e，TMRITC) 藻红蛋白（R-RE) 实际上目前应用最多的只有异硫氰酸荧光素一种。,(1) FITC标记 FITC为黄色结晶形粉末，分子量为389.4，易溶于水和酒精等溶剂中，溶解后呈黄绿色荧光，最大吸收光谱为490-495nm，FITC的溶液不稳定，易因水解或迭聚而变质，故需在配好后2h内应用。 FITC含有异硫氰基，在碱性条件下能与IgG的自由氨基（主要是赖氨酸的-氨基）结合，形成荧光抗体结合物。一个分子的IgG有86个赖氨酸残基，但一般最多只能标记15-20个。,异硫氰酸荧光素(FITC),(2) RB200标记 本品为无定形褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保
6、存，分子量为580，最大吸收光谱为570nm，呈明亮的橙色荧光，因与FITC的黄绿色有明显区别，故被广泛用于对比染色或用于两种不同颜色的荧光抗体的双重染色。结合时间持续12-18h。,FITC+RB200标记,(3) TMRITC标记 TMRITC为紫红色粉末，性能比较稳定，分子量为443，最大吸收光谱为550nm，呈橙红色荧光。其结合方法与FITC的直接标记法相同，只是所加色素量为蛋白质量的1/30-1/40，结合时间持续16-18h。,其它荧光物质 1）镧系螯合物 铕、铽、钐、铈等 2）酶作用后产生荧光的物质（荧光底物） 4甲基伞酮-D半乳糖苷 四、荧光免疫分析常用仪器设备 荧光显微镜 荧
7、光分光光度计 流式细胞仪,荧光显微镜 光源：高压汞灯、氙灯、卤素灯 滤板：隔热滤板、激光滤板（UG、BG）、吸收滤板（OG、GG） 光路：透射光、落射光,a 透射光 b 落射光,第二节 荧光抗体的制备 1.免疫血清的制备 制备高效价的特异性抗血清是免疫荧光技术成功的前提。通常以高效价的免疫血清为好，因为用这种血清制备荧光抗体，即使其中含有少量非特异抗体，也可以通过稀释法将其除去。 为提高血清效价，在制备免疫原时，通常采用大剂量加佐剂，长程免疫，其中以弗氏不完全佐剂最常用。即按抗原1份，无水羊毛脂1份，液体石蜡2份混合，待充分乳化后，免疫动物，即可能获得高效价的免疫血清。,搅拌法（直接标记法）
8、取抗体球蛋白溶液10ml，碳酸盐缓冲液3ml，生理盐水17ml，混合，在4电磁搅拌下加FITC3mg（先溶解在3ml缓冲液中），在4继续搅拌4-6h，将结合物通过已平衡好的Sephadex G25柱，以除去未结合的游离荧光素。,2 荧光素标记, 透析标记法 适用于小体积的标记。 将抗体球蛋白溶液用碳酸盐缓冲液（0.25mol/L，pH9.0调动1% (W/V )，并装入透析袋中，按蛋白质量的1/20称取FITC溶于10倍抗体溶液量的碳酸盐缓冲液中，将透析袋浸没于FITC液中，于4搅拌16-18h取出透析袋于0.01mol/L，pH7.2 PBS中透析4h，将结合物通过已平衡好的Sephadex
9、 G25柱，去除游离荧光素。,影响标记的主要因素 温度:温度低，标记时间长，温度高，标记时间 应短。 时间:FITC0-4以6-12h为宜，20-25以1-2h为 宜，3730-45min为宜。 酸碱度:pH低时，标记较慢，pH值偏高（10）， 抗体易变性，pH值9.0-9.5最为适宜。 标记量:抗体蛋白含量低，标记慢，以每毫升含 20-25mg蛋白为宜。,3 免疫球蛋白的提纯 用于荧光素标记的免疫血清，需提纯后使用，这样不但可以提高抗体的效价，而且还可以排除球蛋白以外的蛋白质，减少非特异性荧光的出现。 从免疫血清中将特异性抗体提纯与荧光素标记是免疫荧光技术的关键一环。,在免疫荧光技术中所应用
10、的特异性抗体， 主要是IgG类，其提纯方法很多，但以 饱和硫酸铵盐析法比较简便； 也可用分子筛层析法（即葡聚糖凝胶过滤）； 以及离子交换层析法等； 或先用盐析法精提，然后再经过层析柱进一步纯化。,标记抗体溶液 透析或凝胶过滤 DEAE-纤维素层析 抗原交叉吸收或组织制剂吸收 荧光抗体活性鉴定,（去除游离荧光色素）,粗制荧光抗体,（去除过度标记的蛋白分子）,精制荧光抗体,（去除特异交叉反应的标记抗体 ）,免疫纯荧光抗体,标记抗体的纯化,F/P=,1.5(固体标本）,2.4(活细胞染色）,第三节 免疫荧光显微技术 免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发
11、生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。 免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。,一、标本的制作 1.涂片、印片、切片 2.标本的固定 通过固定，不仅使标记的抗体易于接近抗原，从而发生反应，而且要求标本中的抗原的活性不受损失，同时还要保护其自然形态和位置。 因此，根据所研究的抗原和组织细胞种类的不同，相应地采用不同的固定方法。应用最广泛的固定液是丙酮和乙醇，其次是甲醇、甲醛、丙烯醛等。切片标本大多用乙醇固定，组织培养标本主要用丙酮固定。,二、荧光抗体染色 1） 直接法 1标本经
12、固定后，PBS洗涤33分钟。 2加荧光素标记的抗体，湿盒内37孵育50 分钟。 3PBS洗涤33分钟。 40.1伊文氏兰复染。 5PBS洗3次，蒸馏水洗2次，每次3分钟，以 除去NaCl结晶。 6缓冲甘油封片，镜检。,直接染色法 优点是：特异性高，操作简便，比较快速。 缺点是：一种标记抗体只能检查一种抗原， 敏感性较差。 直接法应设阴、阳性标本对照，抑制试验对照。,2） 间接法 1标本固定后，PBS洗涤33分钟。 2滴加一抗，37 40分钟或4过夜。 3PBS洗涤33分钟。 4滴加荧光标记二抗37 40分钟。 5PBS洗涤33分钟。 60.1伊文氏兰复染。 7PBS洗涤33分钟。 8缓冲甘油封
13、片，镜检。,间接染色法 优点：既能检查未知抗原，也能检查未知抗体； 用一种标记的抗球蛋白抗体，能与在种 属上相同的所有动物的抗体结合，检查 各种未知抗原或抗体，敏感性高。 缺点：由于参加反应的因素较多，受干扰的可 能性也较大，判定结果有时较难，操作 繁琐，对照较多，时间长。 间接法应设阴、阳性标本对照，还应设有中间 层对照（即中间层加阴性血清代替阳性血清）。,三、荧光显微镜检查 染色当天即做镜检 选择好光源和滤光片 3 阳性细胞的数量和荧光强度均可作为荧光显微镜检查的定量或半定量的指标。,第四节 免疫荧光技术在医学检验中的应用 1 用作细菌、病毒和寄生虫的检验 用来检测自身抗体，在自身免疫病的实验 诊断中应用广泛。 3 间接免疫荧光技术可用于检测血清中的抗体，用于流行病学调查和临床回顾诊断。,
