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1、白细胞分化抗原和细胞粘附分子测定,第一节 白细胞分化抗原 一、白细胞分化抗原的概念,白细胞分化抗原是指血细胞在分化成熟为不同谱系（lineage）、分化的不同阶段及细胞活化过程中，出现或消失的细胞表面标记分子。,CD分子概念,CD （cluster of differentiation），分化群。将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原归为一个分化群，每一CD分子代表一种或一类分化抗原。人CD的编号已从CD1命名至CD247，可大致划分为T细胞、B细胞、髓系细胞、NK细胞、血小板、粘附分子、内皮细胞、细胞因子受体和非谱系等九个组。,白细胞分化抗原的分类,根据人白细胞分化抗原胞膜外区结构
2、特点,可分为不同的家族（family）或超家族（superfamily），常见的有： 免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IgSF）、 细胞因子受体家族（cytokine receptor family）、 C型凝集素超家族、 整合素家族（integrin family）、 肿瘤坏死因子超家族（tumor necrosis factor superfamily，TNFSF）、 肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）等。,二，白细胞分化抗原测定,花环法简便易行，不需特殊仪器，试剂相对便宜，是较经典的T淋巴细胞检测方法，但影响因素较多，个人主观性较强，结果不太稳
3、定，各实验室间的检测结果可比性较差。,（4）流式细胞术,流式细胞术是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或颗粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）进行定性或定量检测的一种细胞分析技术。由于流式细胞术可同时鉴别单个细胞上的多种抗原，而且在极短时间内分析大量细胞，因此在医学基础研究和临床疾病的诊断、治疗及发病机制研究中得到了广泛应用。,特点,1,各种组织细胞均可用于分析,如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞等，实体组织经处理后制成单细胞悬液均能分析。 2,测量速度快，每分钟能测量数千至数万个细胞。 3,可进行多参数的分析, 可同时检测四种不同荧光染色的细胞。新
4、一代的流式细胞仪可同时检测三十二色的细胞。 4,可将目的细胞无菌分选出来做进一步的培养。,三，白细胞分化抗原测定的应用 （一）在免疫学中的应用,淋巴细胞免疫表型分析,根据淋巴细胞的功能及膜表面标记，主要分为T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞三个亚群，但三者在普通光学显微镜下不能区分，血细胞分析仪也无法鉴别，只有用流式细胞仪结合单克隆抗体技术才能准确分类计数淋巴细胞亚群。,经常测定的淋巴细胞免疫标记包括： T淋巴细胞 ：CD3、CD4、CD8, T 辅助细胞 ：CD3+CD4+, T 抑制细胞：CD3+CD8+, B 淋巴细胞：CD19、或CD20， NK 细胞 ：CD56、CD16， 活化细胞：
5、CD25、HLA-DR、 CD40L、CD71。,流式检测人外周血淋巴细胞亚群的正常参考范围 CD3+ 70.012.0% CD3+CD4+CD8- 40.09.0% CD3+CD4-CD8+ 30.08.0% CD3-CD56+(NK) 12.08.0% CD19+ 8.03.0% CD4+/ CD8+比值： 1.0 - 2.5,1，原发性免疫缺陷病：T淋巴细胞缺乏，或B淋巴细胞缺乏或减少。 2，HIV感染与AIDS：CD4+淋巴细胞的百分比和数量减低。 3，SARS： T淋巴细胞（CD3+细胞）绝对数减少最为显著。 4，自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等自身免疫疾病患者CD4+
6、/CD8+细胞比值异常。 5，造血干细胞移植后免疫重建：NK细胞首先开始升高，随后T淋巴细胞和B淋巴细胞开始恢复，CD4+/CD8+细胞比值约在第二年才能逆转（1）。,6，移植后免疫监测：动态监测血液CD2+、CD3+、CD25+表达的变化，当其持续增高时提示发生移植排斥反应； CD4+/CD8+细胞比值持续减低表示移植后感染，若比值0.2时应停用免疫抑制剂，以免继发严重感染而导致移植失败。 7，实体肿瘤疗效观察：恶性肿瘤患者治疗前CD3+细胞数量、CD4+/CD8+细胞比值常减低，化疗或放疗有效时则可逐渐恢复或达到正常水平。淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常较好。,（二）在血液学
7、中的应用： 概念：白细胞分化抗原(LDA,CD),CD (cluster of differentiation)指的是分化群或分化簇。在使用CD命名细胞膜表面免疫标志的初期，指白细胞膜上的抗原，故又称白细胞分化抗原。 目前“CD”代表的不仅仅是白细胞表面抗原，还有红细胞膜表面抗原、血小板表面抗原、髓系细胞表面抗原及其他组织细胞表面或细胞内的抗原等，研究方法以流式细胞术检测法为主。,1，白血病的免疫分型： 白血病免疫学分型是利用单克隆抗体(McAb)检测白血病细胞的细胞膜和细胞浆抗原（CD）,分析其表现型,以了解被测白血病细胞所属细胞系列（如髓系、红系、淋巴系等白血病亚型）及其分化程度。对白血病
8、细胞抗原的分析研究有助于对白血病分型，为诊断和治疗提供依据。,举例：T系急性淋巴细胞白血病免疫表型特点（T-ALL）： 根据T淋巴细胞在胸腺内的成熟顺序，将T-ALL分为早期、中期和晚期三类。早期T-ALL：表达CD7和CD1a，CD4、CD8膜CD3均为阴性；中期T-ALL：除表达CD7和CD1a外，还表达CD2、CD5，CD4/CD8同时表达，膜CD3仍为阴性；晚期T-ALL：膜CD3为阳性，但丢掉CD1a，其他标志同中期。通过检测CD抗原来确定白血病分期。,2，淋巴瘤免疫分型： 淋巴瘤的免疫分型也是利用单克隆抗体检测淋巴瘤细胞的细胞膜和细胞浆抗原,分析其表现型,以了解被测淋巴瘤细胞所属细
9、胞系列及其分化程度。如 B细胞系淋巴瘤T/NK细胞系淋巴瘤淋巴细胞系以外的造血细胞肿瘤造血细胞以外的肿瘤等。,3，残留白血病检测 ： 是指白血病经治疗后获得完全缓解后体内残留少量白血病细胞的状态。而少量的白血病细胞在形态学上难以辨认，因此，用流式细胞仪能够准确、快速地检测残存白血病细胞，指导治疗。,4，血小板功能分析 ： 血小板质膜糖蛋白单克隆抗体CD41(GPIIb/IIIa)、CD61(GPIIb/IIIa)、CD42b (GPIb)、CD41b (GPIIb)、血小板颗粒膜糖蛋白CD62p、CD63的测定可供分析血小板功能状态，如CD62p、CD63正常血小板不表达，当血小板活化时表达明
10、显增加，可用来测定活化血小板,5，造血干/祖细胞测定： 造血干/祖细胞移植已广泛应用于治疗血液肿瘤、实体瘤、某些遗传性疾病、免疫缺陷病等。CD34分子是造血干细胞的重要标志。造血干/祖细胞存在于外周血中，但浓度很低，需用生长因子动员，使CD34+细胞达到一定水平，才能进行移植。,第二节 细胞黏附分子 一、黏附分子概述,是介导细胞与细胞或细胞与细胞外基质间相互接触和结合的一类膜表面糖蛋白分子。 以受体与配体方式相互作用，通过增加细胞间粘附作用和或传递信号而促进细胞的功能。,概 念：,选择素家族selectin 整合素家族integrin 粘蛋白样家族mucin-like family Ig超家族
11、IgSF 钙粘蛋白家族cadherin 另外,还包括一些尚未归类的粘附分子,分 类：,生物学功能：多样的和互相重叠的。,参与肿瘤扩散和转移,参与胚胎发育和分化,维持正常组织结构,参与调节免疫应答,参与调节炎症反应,参与凝血和血栓形成，创伤愈合,二、细胞表面粘附分子测定,（一）酶免疫组织化学测定 将酶标抗特定粘附分子抗体加到组织切片标本上，洗涤后加底物显色。显微镜下观察结果。 （二）荧光免疫方法 抗体为荧光标记的抗特定粘附分子抗体。,（三）流式细胞仪测定,适用于内皮细胞、淋巴细胞等表面的粘附分子测定 （四）时间分辨荧光免疫测定 用镧系元素铕（Eu）、铽（Tb）、钐（Sm）的螯合物标记特异的抗粘附
12、分子抗体，当其与粘附分子结合后，在紫外光激发下发出荧光。,不同元素发出的荧光波长不同，荧光强弱与粘附分子含量成正比，从而可同时测定多个粘附分子含量，并且不受非特异荧光干扰。 （五）酶免疫显色法及酶免疫化学发光法 以细胞为检测标本。细胞-ELISA,三、可溶性粘附分子的测定,测定标本为血清或其他体液，测定方法为ELISA、RIA、化学发光、时间分辨等。,四、细胞粘附分子基因及基因表达的测定,（一）细胞粘附分子基因的多态性测定 1、PCR-SSCP（PCR-单链构型多态性) 2、PCR-RFLP（PCR-限制性片段多态性） 3. PCR-ASO (PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针） 4. PCR-SSO (PCR-序列特异性寡核苷酸探针） 5. PCR-SSP (PCR-序列特异性引物分析法） 6. PCR-DNA测序 7. 实时荧光PCR-荧光标记双探针法 （二）细胞粘附因子基因表达的测定 实质是测定细胞粘附分子的mRNA。 RT-PCR,五、细胞粘附分子测定的应用,探讨疾病发生发展的机制 疾病的临床诊断及预后。,
