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1、微生物学实验,课堂纪律,严格遵守实验室规章制度 严肃课堂纪律 不允许无故旷课、早退（1次） 迟到（3次） 不能做与实验无关的事,实验室安全和卫生,安全 实验室严禁吸烟。 注意用水、防电和防火 正确使用化学试剂和仪器,卫生 每次实验需留下6位同学值日，协助保持实验室清洁,1、了解培养基的概念、种类和用途，明确培养基的配制原理。 2、学习掌握培养基配制的一般方法和步骤。 3、掌握高压蒸汽灭菌的原理和方法步骤。,实验目的,一 培养基的配制,培养基(culture medium)是指人工配制的、适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。 自然界中微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究目的不同，
2、所以培养基的种类很多，不同种类的培养基一般都应含有微生物生长所需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水六大营养要素，且各成分比例应合适。 为了满足微生物生长繁殖或积累代谢产物的要求，还必须控制培养基合适的pH。,实验原理,常用凝固剂是琼脂，固体培养基琼脂加量通常为1.5%-2%；半固体培养基琼脂加量为0.5%-0.8%。,实验原理 (continued),常用培养基： 牛肉膏蛋白胨培养基广泛用于细菌的培养；高氏一号培养基用于培养放线菌；麦芽汁培养基和豆芽汁培养基通常用于酵母菌的培养；马铃薯葡萄糖培养基被广泛用于培养霉菌。,牛肉膏蛋白胨培养基配方：,牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g
3、 琼脂 15-20g 水 1000ml pH 7.4-7.6,5-6人一组，每组 500ml 斜面2支（每人），余装三角瓶,1、称量及溶化,2、调pH,3、加琼脂、溶化、定容、（过滤）,4、分装（每人2只试管）、加塞、包扎,5、灭菌,6、摆斜面,操作步骤,称量与溶化：,注意： 1）牛肉膏的称取：用玻璃棒蘸取适量牛肉膏，抹于称量纸上，勿取过量，不足时，再蘸取少量，逐步添加；然后将牛肉膏连同称量纸放入水中，稍等片刻牛肉膏即从称量纸上脱落，用玻璃棒将纸捞出即可。,操作步骤 (continued),加琼脂、溶化、定容、（过滤）, 琼脂一般应在调好了pH后加入，琼脂的加入不会影响培养基的pH。 琼脂加入
4、后应煮沸数分钟，以使其完全溶化，否则易出现分布不均，导致部分斜面不凝固或过软，另外部分则琼脂过多。 加热过程中因水分蒸发而可能使培养基体积减小，应补充水分至所需量。,操作步骤 (continued),分装：,1）装量： 液体试管高度的1/4左右 固体试管高度的1/5 ，灭菌后摆斜面 半固体一般为试管高度的1/3，灭菌后垂直放置,操作步骤 (continued),分装：,2）分装装置：,操作步骤 (continued),3）注意： 分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染；若不慎沾在了管口，可用湿纱布揩净。,棉塞制作方法：,加塞： 棉塞 或 硅胶塞 作用：防止外界微生物
5、进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能。,包扎：,加塞后，试管通常每7支一起，包上一层牛皮纸或两层报纸，用线绳扎紧。三角瓶加塞后也用牛皮纸包扎。 以活结形式扎紧，以便使用时容易解开。 用记号笔注明培养基名称、配制日期、配制人或实验组。,操作步骤 (continued),灭菌时包牛皮纸,灭菌：, 培养基灭菌一般采用压力蒸汽灭菌 通常灭菌条件为1.05kg/cm2, 121.3灭菌20分钟；含糖量高的培养基，如马丁氏培养基则为0.56kg/cm2,112.6灭菌30分钟。 操作步骤详见下一课件,操作步骤 (continued),摆斜面：, 成扎摆放，不需将每支试管单独摆放 最好待培养基冷至6
6、0时摆斜面，以免形成大量冷凝水,无菌检查：,将灭菌的培养基放在37温箱中培养24-48小时，以检查灭菌是否彻底。,二 消毒与灭菌,加热法,干热法 湿热法,火焰烧灼 热空气灭菌,压力蒸汽灭菌 间歇灭菌 煮沸灭菌 巴斯德消毒,实验原理,1、了解掌握常用消毒、灭菌方法的原理。 2、学习掌握干热灭菌和压力蒸汽灭菌操作步骤。,实验目的,滤膜过滤器的滤膜是一种多孔纤维素，孔径一般为0.45um，过滤时，液体和小分子物质通过，细菌被截流在滤膜上。,过滤除菌 许多材料，如血清、糖溶液等，用一般加热消毒灭菌方法，均会被热破坏，应采用过滤除菌。 应用最广的过滤器有蔡氏(Seitz)过滤器和膜过滤器。,紫外线灭菌
7、紫外线波长在200-300 nm,具有杀菌作用，其中以265-266 nm杀菌力最强。 无菌室或无菌接种箱空气可用紫外线灯照射灭菌。,实验原理 (continued),干热灭菌,电烤箱,实验内容及实验步骤 1、干热灭菌 2、压力蒸汽灭菌,干热灭菌,1、装入待灭菌物品 2、升温 接通电源，加热升温至160-170。 3、恒温 保持160-170 2小时。 4、降温 切断电源，自然降温。 5、开箱取物 待烤箱温度降到70以下以后，方可打开箱门，取出物品。箱内温度高于70，切勿自行打开箱门，以免玻璃器皿炸裂。,实验内容及实验步骤 (continued),实验内容及实验步骤 (continued),压
8、力蒸汽灭菌,压力蒸汽灭菌,1、检查水位，放入物品。,2、加盖、拧紧 对称用力 3、加热升温 4、排冷空气 等压力升至0.5kg/cm2时，打开排气阀，排净冷空气。 5、升温、保压 等锅内压力升至所需数值（通常为1.03kg/cm2），保持压力20-30分钟。 6、降压、取物,实验内容及实验步骤 (continued),三 油镜的使用,学习并掌握普通光学显微镜的构造和油镜的使用技术及维护的基本知识 初步认识细菌的基本形态,实验目的,实验原理1,显微镜的构造 1.光学部分:目镜 、 物镜 、 照明装置(聚光镜、 虹彩光圈、 反光镜等)。它使检视物放大,生成物象。,2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、物
9、镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件.它起着支持 调节 固定等作用.,图1-1-2 光学显微镜的成像原理,油镜使用的原理 油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。,浸没油与玻璃的折射率相近,很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的 光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。,二、显微操作,现场演示,1.低倍镜观察：粗调、细调。依次再进行中倍、高倍观察 2.油镜观察：高倍镜下
10、找到清晰的物象后，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 3.换片：另换新片，必须从第1条开始操作。 4.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量乙醚酒精或二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的乙醚酒精或二甲苯，后将镜体全部复原。 注意：油镜使用完毕后一定要用乙醚酒精或二甲苯擦拭镜头,用油镜观察细菌三形永久装片。,1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 5.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。,显微镜保养和使用中的注意事项,实验报告与问题讨论,1、思考题 1）在配制培养基过程中应注意哪些问题？为什么？ 2）培养基配制好后，为什么要立即灭菌？如何检查灭菌是否彻底？ 3）压力蒸汽灭菌时，为什么要将锅内冷空气排尽？ 4）使用油镜时，为什么必须用香柏油？,本次实验课结束 请确保油镜头擦拭干净！ 请第一组同学留下值日 下周再见！,
