浙大生物化学课件2：蛋白质2

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1、生 物 化 学,浙江大学 生命科学学院 江 辉,第二章 蛋白质化学 第三节 蛋白质的结构,蛋白质的结构,一级结构：即初级结构，是指蛋白质多肽链的氨基酸顺序。 二级结构：是指蛋白质多肽链主链在空间的走向，一般为有规律的空间排列，是主链的构象，而不涉及侧链基团的空间上的关系。 超二级结构 结构域 三级结构：是指蛋白质分子中所有原子的三维空间排列。 四级结构：是研究多亚基蛋白质分子内各亚基间的相互关系和空间位置。,一、蛋白质的一级结构,蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。 1954年英国生化学家Sanger报道了胰岛素的一级结构，是世界上第一例确定一级结构的蛋白质。Sanger由此1958年

2、获Nobel 化学奖。 1965年我国科学家完成了结晶牛胰岛素的合成，是世界上第一例人工合成蛋白质。 蛋白质的一级结构由遗传信息决定，其一级结构决定高级结构，一级结构是基本结构。但一级结构并不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。,蛋白质一级结构测定的意义,许多先天性疾病是由于某一重要的蛋白质的一级结构发生了差错引起的。如血红蛋白亚基6 位Glu被Val代替（基因突变），即表现为镰刀状贫血，为世上最常见的血红蛋白病。若亚基6位Glu被Lys取代引起另一类贫血：血红蛋白C病。 比较不同生物细胞色素C的一级结构可以帮助了解物种间的进化关系，物种间越接近，则细胞色素C的一级结构越相似。,通过蛋白质一级结构

3、的序列比对，预测蛋白质的功能,（b）每个肽键的形成都丢失一个水分子，故肽键中的氨基酸称氨基酸残基。 （c）各种肽链的主链结构一样，但侧链R基即氨基酸残基的顺序不同。 （d）一条多肽链通常在一端含有一个游离的末端氨基，称N端；另一端含一个游离的末端羧基，称C端。,1、肽和肽键结构,（a）肽链骨架,2、肽的命名,从N端氨基酸开始，称某氨基酰某氨基酰某氨基酸 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为： Ser-Gly-Tyr-Ala-Val 或者 SGYAV,3、蛋白质一级结构的分析,总体思路： 1、将蛋白质水解成肽段测定各个肽段中氨基酸序列：

4、2、用两种或两种以上的专一性的水解方法，各自得到一套肽段文库用片断重叠法拼凑； 3、如有两个以上亚基，先分离：如有二硫键，先打断。,具体步骤,分离纯化 氨基酸组成（酸水解、碱水解） 末端分析亚基数量 亚基的拆分（二硫键的打断） 各个亚基氨基酸组成、末端分析 亚基用两种或两种以上的专一性水解方法肽段文库 肽段测序 肽段序列拼凑成亚基序列,蛋白质专一性水解方法,酶解法： 胰蛋白酶（碱性氨基酸Lys和Arg的羧基形成的肽键） 胰凝乳蛋白酶（侧链含芳香环的氨基酸的羧基形成的肽键） 胃蛋白酶（疏水性氨基酸的羧基和疏水性氨基酸的氨基形成的肽键） 化学裂解法：溴化氰（高度专一地在甲硫氨酸羧基形成地肽键处断裂

5、肽链）,4、肽段测序,N-末端分析之一：Sanger法（二硝基氟苯反应）,N-末端分析之二：Edman降解（N-段测序）,Edman降解的优点：除了N-段氨基酸，其它肽段不被水解，可以继续被测定,无水,其它N-末端分析方法,丹磺酰氯法（DNS法） 氨肽酶法,C-末端分析,肼解法 还原法 羧肽酶法,二硫键的拆分,二、蛋白质的二级结构,二级结构：多肽链中各原子在局部空间或一段肽链的氨基酸残基的空间排布方式。为主链构象，不涉及侧链构象。 构型与构象 构型：立体异构体中取代原子或基团在空间的取向,构型的改变涉及到共价键的破坏或形成,构象：取代基团在单键旋转时可能形成的不同的立体结构,构象的改变不涉及共

6、价键的断裂，构象可以是无数种，其中交叉型的构象最稳定，重叠型的最不稳定。,肽单元（peptide unit），肽键平面,肽键的CN键长为0.132nm，不同于CN单键键长0.149nm，也不同于C=N双键键长0.127nm，其有一定程度的双键性能，C与N不能以CN为轴心自由旋转。 参与肽键的6 个原子C1、C、O、N、H、 C2 被约束于一个平面上，称为肽键平面，为形成二级结构的基础。,两个肽平面以一个C为中心发生旋转。,二级结构类型,1、-螺旋（-helix） 是蛋白质中最常见，含量最丰富的二级结构。, -螺旋的基本结构特征,每圈螺旋含有3.6个氨基酸残基。 每圈螺旋沿螺旋轴方向上升0.54

7、 nm。 每个氨基酸残基绕轴旋转100度，沿轴上升0.15 nm。 多肽链主链上的每个肽键（N）中的羰基氧原子都与其后的第四个氨基酸残基（N+4）上的酰胺基形成氢键，氢键的方向与螺旋轴平行。, -螺旋结构形成的限制因素:,凡是有Pro存在的地方，不能形成因Pro形成的肽键N原子上没有H，不可能形成氢键。 静电斥力若一段肽链有多个Glu或Asp相邻，则因pH=7.0时都带负电荷，防碍螺旋的形成；同样多个碱性氨基酸残基在一段肽段内，正电荷相斥，也防碍螺旋的形成。 位阻如Asn、Leu侧链很大，防碍螺旋的形成。,2、 -折叠（- sheet）,是蛋白质中另一种常见的二级结构。 两条或多条伸展的多肽链

8、侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的NH和C=O之间形成有规则的氢键。,3、 转角 （ turns）,球状蛋白中的一种二级结构，常出现在蛋白质的表面。 折叠反平行式的转折处。第一个残基的C=O与第四个残基的NH形成氢键。,脯氨酸和甘氨酸常在这种结构中存在。脯氨酸具有环状结构和固定的角，能迫使转角的形成；甘氨酸缺少侧链，在转角中能很好地调整其他残基的空间阻碍。,4、无规卷曲,泛指那些不能被列入明确的二级结构，如螺旋或折叠的多肽区段。,5、超二级结构,指由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成的有规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，又可称为模体（motif）。,蛋白质空间构象的

9、正确形成除一级结构为决定因素外，还需要一类称为分子伴侣（chaperon）的蛋白质参加。 分子伴侣可防止错误的聚集发生，使肽链正确的折叠；也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。 分子伴侣对二硫键的形成起重要作用。,6、结构域（domain）,结构生物学定义：较大的蛋白质分子或亚基在三维折叠的过程中，多肽链往往先形成两个或两个以上的相对独立的三维实体，然后这些三维实体再通过缔合形成蛋白质的三级结构。一般将这种相对独立的三维实体称为结构域或域结构。 功能生物学定义：蛋白质分子中能独立执行某项功能的单位。,肌钙蛋白的两个不同的钙结合域,聚酮合酶（PKS）结构域,4、纤维状蛋白,-螺

10、旋是-角蛋白的基本结构单位,A）-角蛋白： 属于不溶性的纤维蛋白。主要存在于动物的毛发、皮肤、蹄、角、指甲等组织中。,烫发的原理,B）丝心蛋白,蚕丝、蜘蛛丝 以反平行-折叠片以平行的方式堆积成多层结构 Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser重复结构,C）胶原蛋白,是脊椎动物中含量最丰富的蛋白质。皮肤、软骨、动脉管壁、结缔组织主要成分。 胶原蛋白中缺乏Cys和Thr，含有Gly-X-Y的重复结构，X多为Pro，Y多为4-羟脯氨酸。,三螺旋结构分子内和分子间共价交联二硫键,三、蛋白质的三级结构,是指蛋白质分子中的所有原子的三维空间排列，包括它的二级结构要素和它的侧链在空间上的相互关系。 维

11、持蛋白质三级结构的主要作用力为侧链间的相互作用：氢键、离子键、范德华力、疏水键及二硫键。,氢键,XH-Y X、Y是负电性强的原子，XH是共价键，H-Y是氢键，X是氢（质子）供体，Y是氢（质子）受体。 多肽主链上的羰基氧和酰氨氢之间形成的氢键是维持蛋白质二级结构的主要作用力。 在侧链与侧链、侧链与介质水、主链肽基与侧链或主链肽基与水之间形成氢键，参与三级结构。,疏水相互作用,水介质中球状蛋白质总是倾向把疏水残基埋藏在分子的内部，这称疏水相互作用（疏水效应）。 疏水相互作用是疏水基团或疏水侧链出自避开水的需要而被迫接近。,离子键,在生理pH下，酸性氨基酸（Asp、Glu）的侧链可解离成负离子，碱性

12、氨基酸（Lys、Arg、His）的侧链可解离成正离子。大多数情况下，这些基团分布在球状蛋白分子表面，与介质水分子发生电荷-偶极之间的相互作用形成排列有序的水化层，对稳定蛋白质构象有一定作用 (负电荷-H+-OH，正电荷-HO-H+) 。,二硫键,是肽链内部或肽链间的半胱氨酸的巯基之间形成的共价键，它对稳定构象起作用。 大多数二硫键在-转角附近形成。,范德华力,包括三种较弱的作用力： （1）定向效应：发生在极性分子或基团之间，是永久偶极间的静电相互作用，氢键属于这种范德华力。 HO-HO- （2）诱导效应：发生在极性物质与非极性物质之间，是永久偶极与由它诱导而来的诱导偶极之间的相互作用。 HO-

13、 CH3,（3）分散效应：为主要的范德华力，是非极性分子或基团间的相互作用。这是瞬时偶极，即偶极方向瞬时变化，是由其所在的分子或基团中电子电荷密度的波动所造成的。 CH3CH3 范德华力包括吸引力和斥力两种相互作用。因此，范德华力（吸引力）只有当两个非键原子处于一定距离时才达到最大，这称范德华距离（=两个原子的范德华半径之和）。,细胞色素C,溶菌酶,核糖核酸酶,几种球状蛋白的三级结构,膜蛋白,（1）内嵌蛋白,（2）外周蛋白,脂锚定膜蛋白,四、蛋白质的四级结构,四级结构：亚基的种类和数目、各亚基的空间排布。 亚基（subunit）：有的蛋白质分子由两条以上的肽链通过非共价键相连聚合而成，每条多肽

14、链称为一个亚基，即每个三级结构的球状蛋白质。也称单体蛋白质。 维持四级结构稳定的因素为各亚基之间的作用力如氢键、离子键、范德华力、疏水键及二硫键。 含有四级结构的蛋白质，单独的亚基一般没有生物学功能，只有完整的四级结构才有生物学功能。,五、变性与复性,变性：天然蛋白质受到某些物理因素如热、紫外线照射，高压和表面张力等或一些化学因素如有机溶剂、尿素、酸、碱等的影响时，生物活性丧失，溶解度降低以及其他的物理化学常数发生改变，这个过程称为蛋白质的变性。 变性作用的实质是蛋白质分子中的次级键被破坏，引起天然构象解体，但变性不涉及共价键的破裂，即蛋白质的一级结构保持完整。,变性过程中蛋白质的变化,生物活

15、性丧失 一些侧链基团暴露 一些物理化学性质的改变 生物化学性质的改变,复性,当变性因素去除后，变性蛋白又可以重新回复到天然构象，这一现象称为蛋白质的复性。,蛋白质折叠过程的中间体,第四节 蛋白质结构与功能的关系,肌红蛋白（myoglobin）（单亚基蛋白）,鲸肌红蛋白分子是由一条多肽链和一个血红素辅基构成的。多肽链含有153个氨基酸残基，折叠成8个-螺旋。,肌红蛋白三级结构,肌红蛋白中卟啉环,肌红蛋白在与氧结合过程中构像改变,卟啉平面的变化,肌红蛋白氧气结合曲线,血红蛋白（hemoglobin）（多亚基蛋白）,由两个-亚基和两个-亚基组成的四聚体，-亚基含141个氨基酸残基，-亚基含146个氨

16、基酸残基。 肌红蛋白含有153个氨基酸残基。 血红蛋白-亚基、 -亚基和肌红蛋白的一级结构差别很大（27个氨基酸相同）。 血红蛋白-亚基、 -亚基和肌红蛋白的高级结构非常相似。,血红蛋白-亚基和肌红蛋白的高级结构,血红蛋白四级结构,血红蛋白在与氧结合过程中构像改变,紧张态,松弛态（氧结合态）,紧张态T,松弛态R（氧结合态）,氧结合曲线,血红蛋白氧结合曲线,肌红蛋白氧结合曲线,别构效应,多亚基蛋白一般具有多个结合部位，结合在蛋白质分子的特定部位上的配体对该分子的其他部位产生的影响称为别构效应。 具有别构效应的蛋白质称别构蛋白质，具有别构效应的酶称别构酶。 别构效应分为同促效应和异促效应。,同促效应,发生作用的部位是相同的，例如都是活性部位，即一个亚基活性部位与配基的结合会影响另一个亚基活性部位与配基的结合。 如果这种影响是促进作用，则是正协同效应； 如果这种影响是降低作用，则是负协同效应。