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1、课题1：微生物的实验室培养,到目前为止，几十项Nobel生理学和医学奖，化学奖都与微生物学有关,1.微生物：是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称,细菌的外形与大小,图1-1 常见的三种细菌典型形态 A.球菌 B.杆菌 C.弧菌,芽孢,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。,孢子,细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的生殖细胞。能直接发育成新个体。,单个
2、或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。,2.特征：,大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。,3.功能：,1.定义：,菌落,鉴定菌种的重要依据,菌落,细菌的菌落特征因种而异,放线菌,1、结构： 单细胞原核 分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）,链霉素、土霉素、四环素、 氯霉素、红霉素、庆大霉素,微生物中发现了几千种抗生素，其中2/3是由放线菌产生的,应用:,培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。,（一）培养基的类型及其应用：,固体培养基,半固体培养基,液体培养基,加入琼脂较多,加入琼脂较少,不加入琼脂
3、,微生物分离,鉴定,计数，活菌保存,观察微生物的运动，分类，鉴定,工业生产,半固体培养基：,无动力 有动力(弥散),(是否运动),液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。 缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,合成培养基:,天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限；成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析；易发生支原体污染。,天然
4、培养基：,血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） 多种金属离子； 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 各种生长因子 转移蛋白 不明成分,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,选择培养基,加入青霉素的培养基: 加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 不加含碳有机物的无碳培养基:,鉴别培养基,在培养基中加入伊红-美蓝:用于大肠杆菌的鉴别 在培养基中加入酚红指示剂：用于分解尿素细菌的鉴定,分离酵母菌、霉菌等真菌,分离固氮菌,分离自养型微生物,（二）.培养基：,微生物生存的环境和营养物质
5、,1.基本成分：,碳源、氮源、水、无机盐,碳源,无机碳源：,有机碳源：,CO2、CO32-、HCO3-,牛肉膏、蛋白胨等,自养微生物,异养微生物,氮源,无机氮源：,有机氮源：,N2、NH3、NH4、NO3-（为硝化细菌提供N源和能源）,牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等,注：含CHON的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源,思考：微生物“吃”什么？,2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 (参考教材附录内容P83),3.不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、 无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如：生长因子（即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物，如维生
6、素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。,牛肉膏蛋白胨培养基 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。,分析营养构成？,5. 配制原则,目的明确：,营养全面、浓度适宜、比例恰当,适宜的pH值：,有机碳源,异养型：,根据微生物的种类、培养目的选择原料,自养型：,不加碳源,加入缓冲剂（KH2PO4，K2HPO4）,细菌偏碱，真菌偏酸,（CO2碳源）,【典例解析】,例2关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ ） A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量,D,例1下列叙述正确的是（ ） A.为微生物的生长
7、繁殖提供营基质的是固体培养基 B.培养基只有两类:液体培养基和固体培养基 C.固体培养基中加入少量水及可制成液体培养基 D.微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的菌落,D,例3下表是对四种微生物的能源、碳源、氮源新陈代谢类型的叙述，正确的是（ ）,B,（三）无菌技术,1.无菌技术的概念,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。无论是随后将要学到的倒平板、平板划线操作，还是平板稀释涂布法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。,消毒定义： 利用化学或物理方法，杀死物体表面或内部的部份微生物（不含芽胞和孢
8、子）的过程。,2.消毒与灭菌的概念及两者的区别,灭菌的定义：,以化学或物理方法消灭物体内外所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。 灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。,1.煮沸消毒法：100煮沸5-6min 2.巴氏消毒法：70-75下煮30min或 80 下煮15min 3.化学药剂消毒法：用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒；氯气消毒水源 4.紫外线消毒,消毒的方法：,3.常用的消毒与灭菌的方法,1.灼烧灭菌 2.干热灭菌：160-170下加热1-2h。 3.高压蒸气灭菌：100kPa、121下维持15-30min。,灭菌的方法：,1
9、.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 培养细菌用的培养基与培养皿 玻棒、 试管、烧瓶和吸管 实验操作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染,答：、需要灭菌；需要消毒。,旁栏思考,例5下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是（ ） A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌 C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前,B,例6下列关于消毒和灭菌的说法，不正确的是（ ） A.灭菌是指杀死环境中的一切微生物的细胞、芽胞和孢子 B.消毒和灭菌实质上是相同的 C.接种环用灼烧的方
10、法灭菌 D.常用消毒方法有煮沸法、紫外线法、化学药品法,B,例7高温灭菌的原理是（ ） A.每种微生物生长的最适温度是一定的 B.微生物对于高温环境不适应 C.高温破坏的细胞内的蛋白质、核酸 D.高温降低了环境中氧的浓度,C,（四）微生物实验室培养的基本操作程序,器具的灭菌,培养基的配制,培养基的灭菌,倒平板,微生物接种,恒温箱中培养,菌种的保存,大肠杆菌的纯化培养：,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,1.计算：,培养基用量,依配方计算各成分的用量,2.称量：,3.溶化：,牛肉膏黏稠，用称量纸称取,牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖,牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解,取纸,蛋白胨、NaCl,琼脂,补水
11、定容,4.调pH、分装、封口：,5.灭菌：,6.倒平板：,培养基、培养皿,分散成单个细胞,形成单个菌落,倒平板,约50,防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染,灼烧灭菌， 防止瓶口的微生物污染培养基,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,问题讨论,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用
12、来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,例8.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是（ ）,A.计算、称量、倒平板、溶化、灭菌 B.计算、称量、溶化、倒平板、灭菌 C.计算、称量、溶化、灭菌、倒平板 D.计算、称量、灭菌、溶化、倒平板,C,例9.有关倒平板操作错误的是（ ）,A.将灭过菌的培养基放在火焰旁的桌面上 B.使打开的锥形瓶的瓶口迅速通过火焰 C.将培养皿
13、打开，培养皿盖倒放在桌面上 D.等待平板冷却凝固后需要倒过来放置,C,二.大肠杆菌的纯化培养：,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,纯化大肠杆菌：,平板划线法：,菌种,划3个平板,1个不划线,1.纯化大肠杆菌的方法：平板划线法和稀释涂布平板法,接种环,防止划破培养基,（重复实验）,（空白对照）,平板划线接种,第一区域,第二区域,第三区域,第四区域,第五区域,平板划线法,平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。,2：每次划线前灼烧接种环的目的：,3：划线结束后灼烧接种环的目的：
14、,平板划线接种,答案：避免接种环上可能存在的微生物污染培养基,答案：杀死上次划线结束后残留的菌种,答案：及时杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和操作者。,1：第一步灼烧接种环的目的：,4.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,5.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,稀释涂布平板法,原理： 将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养
15、基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。,6支试管，分别加入9ml无菌水,101,102,103,104,105,106,稀释涂布平板法：,a.梯度稀释菌液：,菌液,微量 移液器,浸,稀释涂布平板法：,a.梯度稀释菌液：,b.涂布平板：,不超过0.1ml,各梯度分别涂布3个平板,1个不涂布作空白对照,滴,灼,涂,注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管离火焰12cm处.,问题讨论,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管
16、头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。,3平板划线法和稀释涂布平板法的比较,平板划线法：,稀释涂布平板法：,2.培养：,将接种后的培养基和一个未接种的培养基,放入37恒温箱中培养12h24h后，,观察并记录,（三）菌种的保藏：,1.临时保藏：,试管固体斜面培养基上，培养长成菌落,4冰箱保存,2.长期保存：,菌种易被污染、变异,甘油管藏,1ml甘油（灭菌）1ml菌液,20,搁置斜面,四、课题成果评价,（一）培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。 （二）接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明
