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1、细胞凋亡与疾病,Apoptosis and Diseases,早在1972年Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有二种死亡形式,一种是早被熟知的细胞坏死（Necrosis），另一种是创新提出的程序性细胞死亡（Programmed cell death, PCD）学说。但该学说到九十年代初才进入研究高潮，进展极快，现在普遍称之为细胞凋亡（Apoptosis）。,一、细胞凋亡的生理意义,细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种基本生理机制，正常脏器的形态和体积平衡等，都是通过正常的细胞增殖、分化和凋亡三者间的平衡维持的。另外机体还得必需经常地通过凋亡清除损伤的、衰老的和突变的细
2、胞。所以细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡过多或过少都可引起疾病发生。因此，近年来对于细胞凋亡的研究，已成为医学界的关注热点。,二、细胞凋亡的特征,1生化特征：,胞浆内Ca2+浓度升高。 细胞内活性氧增多。 质膜通透性变大。 DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成185bp为基数的有序片段。 型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶（Calpain）活性升高。,2形态学特征：,胞膜完整，外形发泡状， 胞质浓缩，细胞器紧聚。 染色体紧缩呈月牙状，凝聚在核膜周围。 形成膜包的凋亡小体(apoptotic body)， 被附近的细胞或 M 吞噬消化清除。 细胞凋亡可发生在正常细胞群中的单个细
3、胞。,三、细胞凋亡的激发因素,细胞凋亡的参与分子都是在基因控制下组成性存在的，都是以非活性的酶原形式存在。只有当其中某个关键效应分子的酶原被诱导激活后，才引起效应分子间的级联反应，最后导致细胞死亡。 在正常生理情况下，细胞凋亡与细胞增殖一样，是自身平衡进行的，但亦可受许多诱导因素激发加强，或受阻抑因素而减弱。 糖皮质激素、兴奋性神经递质谷氨酸和转化生长因子-(TGF-)可分别激发淋巴细胞、神经元和肝细胞凋亡；IL-2 、 NGF 和睾丸酮可分别阻抑T-淋巴细胞、神经元和前列腺细胞凋亡。,Kerr(1972年)提出细胞凋亡学说，但进展很慢。一直到九十年代才进入研究高潮。 Ellis( 1991年
4、)研究 蠕虫，在其发育过程中凋亡131个细胞 。是与三个死亡基因（cell death gene, ced-3,-4,-9）的调控密切相关。 ced-3和ced-4基因的表达产物呈现促凋亡作用，ced-9基因的表达产物呈现抗凋亡作用。 当ced-9激活时，ced-3和ced-4被抑制，则细胞存活；当ced-9基因不活动时，ced-3和ced-4激活，导致细胞程序性死亡。 以后不断在哺乳动物细胞中发现很多种这三个同源基因及其表达的同源分子，掀起近年来关于细胞凋亡分子生化机理的研究热潮。,一、BcL-2族分子,BcL-2: bcL-2基因是细胞凋亡研究中最受重视的癌基因之一,其表达的蛋白质BcL-
5、2最初发现于B-淋巴细胞瘤/白血病-2（B cell lymphoma/Leukemia-2,BcL-2)而得名，与线虫ced9基因表达的Ced-9分子在结构上有同源性，具有抗凋亡作用。 其中一类呈抗凋亡作用，有BcL-2,BcL-w，BcL-XL、BFL-1、Brag-1、MCL-1，AI。另一类呈现促凋亡作用的，有Bax，Bak,Bok，BcL-Xs，Bad,Bid,Bik，Hrk，Bim等。,二、半胱天冬蛋白酶（caspases）,Yuan (1993年)从哺乳类细胞中发现第1个Ced-3同源分子，叫白细胞介素-1转换酶（Interleukin-1 Converting Enzyme，I
6、CE），Pro-ICE含404个氨基酸，分子量45KD。在一定形式下可自身催化产生20KD和10KD二个片段，聚合形成（p20）2(p10)2杂四聚体，为活化的ICE。到1998年底为止共发现有14个Ced-3同源分子，分别定名为Caspase1-14。,Caspases的分子的结构特征,Caspases的分子均具有下列的结构特征： 以无活性的Pro-Caspases形式存在。 在Pro-Caspases的N端均含有一段P2-P27的前 区域（Prodomain）。 活性形式均是由2个大亚基（1720KD）和2个小亚基（1012KD）组成的杂四聚体。 一分子Pro-Caspase只能分裂产生1
7、个大亚基和1个小亚基 。 在大亚基的C端均含有QACXG（X=R.Q或G）的活性中心，其中半胱氨酸（C）是必需氨基酸，故 Caspase是属于半胱氨酸蛋白酶类。,Caspase的分组,Caspase的分组有的是按其催化特异性而分为三组有的是按其前区域中共含某一具有嗜同性结合功能的区段分为： 1.CARD-Caspase:包括Caspase1,2,4,5,9,11,12,13等。 2.DED-Caspases 包括Caspase-8,10等。 3.下游Caspase 包括Caspase-3,6,7等。,三、细胞凋亡激活因子（Apaf）,自1992-1996年根据Ced-3和Ced-9二个死亡基因
8、的线索，在哺乳动物细胞中发现了大量有关的同源分子，掀起了细胞凋亡研究热潮。 但是关于Ced-4的同源分子在1997年才从哺乳类细胞中发现,称为细胞凋亡激活因子(Apoptosis activating factors，Apafs)，当时认为存在有Apaf-1，2，-3三种，现在知道Apaf-2和-3分别就是细胞色素C（cyt.c）和Pro-Caspase-9，只有Apaf-1才是Ced-4的同源分子。,人Apaf-1含1194个氨基酸残基，其N端1-94氨基酸区段组成CARD(Caspase recruitment domain)，可藉以与Pro-Caspase-9前区域中的CARD互相聚合，
9、再结合Cyt.C形成复合体，称为凋亡体（Apoptosome），在ATP参与下凋亡体内Pro-Caspase-9可自身激活形成活性的Caspase 9。,研究 证实, 在线粒体的内外膜间腔中含有许多涉及细胞凋亡的因子。包括其中特有的细胞色素C（Cytochrome C,cyt C),和凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor,AIF)和Smac（second mitochondria-activator of Caspase),以及与胞浆内共含有的procaspase-2,3,7,9等。 很多内外因素损伤了线粒体膜的完整性，促使线粒体释放出这些凋亡因子，即可诱导引起细胞
10、凋亡。已公认细胞内存有死亡受体介导和线粒体介导的二条细胞凋亡途径。,一、FasL-Fas系统,Fas(Factor associated suicide) 是广泛表达于正常细胞和肿瘤细胞膜表面的型受体，其胞浆段内含有死亡域（Death domain，DD）及阻抑域（Suppresive domain,SD），SD被结合FAP-1（Fas-associated phosphatase-1）后可抑制Fas的诱导凋亡作用。 Fas的配体FasL（Fas Ligand）含281个氨基酸，分子量40KD,基因定位在1q23,主要表达于T效应淋巴细胞和肿瘤细胞，呈现于膜表面的型受体。,Fas和FasL都是
11、以纯三聚体形成存在，在FasL结合于靶细胞膜表面的Fas后，诱导Fas胞浆段内的DD结合FADD（Fas associated Protein with DD）C端的DD，FADD再以其N端的DED（Death effecfor domain）结合Pro-Caspase-8（或-10）的N端的DED,形成一个由Fas-FADD-Pro-caspase-8（或-10）三种分子组成的复合体，称为诱导死亡的信号复合体（Death inducing signaling complex,DISC），其中Pro-Caspase-8（或-10）就可自身催化形成活性的Caspase-8,由此完成了由Fas介导
12、的死亡信号启始转导，接下去进行级联反应激活下游的靶Pro-Caspases（包括Pro-Caspase-3，-6，-7）。,FLIPL（large form of FLICE inhibitory Protein,在Fas介导的凋亡信号转导过程中，除了上述由FAP-1结合其SD进行负调，以及由Caspase-8激活Bid后通过线粒体进行放大信号外，1997年在细胞中还发现一种蛋白质分子，称为FLIPL（large form of FLICE inhibitory Protein）,可借其DED竞争结合Pro-Caspase-8 ,抑制Fas介导的调亡反应。,下游Caspase-3，-6，-7的
13、作用,下游Caspase-3，-6，-7的作用可涉及: 破坏DNA的完整性。如分裂DFF45释放出活性的DFF40 ;分裂PARP（poly-(ADP-Ridbose)poly merase参与DNA修复）和RFC140 ,引起DNA修复和复制障碍。 破裂细胞骨架结构。如分裂胞衬蛋白（Fodrin），凝胶溶介素（gelsolin），actin，keratin，lamin等导致细胞骨架蛋白分解。 影响细胞周期的正常运行。 如分裂cyclin A，pRb,pKC,P21,CdK1等导致细胞周期运行失常。,三、TRAIL-DRs系统,自1997年后不断发现许多新的TNF-类配体及其相应受体。 这些配
14、体有TWEAK和TRAIL ；前者的受体是死亡受体,后者的受体有DR4，DR5和DR6多种。 这些DRs的胞浆段都含有DD，可以结合TRADD、FADD和RIP等接头分子，介导激活Caspase8/10途径促进细胞凋亡。 DcR1/2只表达于正常细胞，肿瘤细胞不表达。,1Cyt.c 由线粒体膜间腔释放入胞浆后，可结合凋亡激活因子-1（Apaf-1） 诱导其寡聚化，再募集Pro-Caspase-9形成凋亡体（Apoptosome），在dATP/ATP参与下Pro-Caspase-9自身激活形成活性的Caspase-9,再级联反应激活下游Caspases导致细胞凋亡。 2凋亡诱导因子（Apopto
15、sis-inducing factor ，AIF）。 AIF是一种DNA内切酶，可直接转位入核内催化DNA约50Kb的大片段化。,Cyt.c 和 AIF,第四节 线粒体介导细胞凋亡的信号转导途径,在细胞凋亡早期，核染色体DNA还未改变之前，线粒体即已出现结构与功能的变化，说明线粒体在细胞凋亡过程中起着重要的早期启动作用。,一、线粒体内的凋亡因子,膜间腔内的凋亡因子有：Cyt.c, 凋亡诱导因子（AIF）, 第二个Caspase的线粒体激活因子（Smac）, Pro-caspase-2,-3,-7,-9和Hsp- 10,Hsp-60等。,3HSP10/60 （Heat shock protein
16、,10/60） 具易化激活Pro-Caspases的作用， 故亦是诱导细胞凋亡的因子。,4第二Caspase的线粒体激活因子Smac（ Second Mitochondria-derived activator of Caspase）,释放入胞浆内可结合凋亡蛋白抑制因子（Inhibitor of apoptotic protein）后进入泛素化蛋白分解，故Smac是线粒体内的第二个激活Caspase的因子 。,二、线粒体膜通透性转变的影响因素,1BcL-2族的促凋亡亚族成员 Bad 在生长因子存在下，促使Bad的Ser112，136磷酸化而抑制其促凋亡活性。在去除生长因子时，则Bad被去磷酸化,Bid,当被Caspase 8催化分裂成N端11KD和C端15KD二个片段，后者即转位线粒体破坏其外膜通透性而导致凋亡放大作用。,2 PKC-,PKC-可直接作用改变线粒体膜的通透性导致凋亡。,3Ca2+i升高,可激活胞浆内的钙调磷酸酶（Calcineurin），后者促使Bad去磷酸
